Detektion reaktiver Sauerstoffspezies im kardiopulmonalen System mittels Electron Spin Resonance (ESR)-Spektroskopie

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS) sind Teil zellulärer und systemischer Signalkaskaden, deren Konzentration durch ein fein abgestimmtes antioxidatives System reguliert wird. Eine exzessive ROS/RNS-Bildung kann hingegen zu oxidativen Schäden und im weiteren Verlauf zu u.a. zu Erkrankungen des kardiopulmonalen Systems und Transplantatabstoßungen führen.Damit haben ROS/RNS auch diagnostische und therapeutische Bedeutung. Der spezifische Nachweis der meisten biologisch relevanten reaktiven Spezies ist jedoch aufgrund ihrer hohen Reaktivität, Diversität und subzellulären Lokalisation schwierig. Aufgrund deren hoher Reaktivität und zahlreicher zellulärer Mechanismen, ROS/RNS zu entfernen, kommen diese in vivo in picomolaren oder geringen nanomolaren Konzentrationen vor. Der ROS-Nachweis in biologischen Systemen erfordert deswegen Sonden, die sehr schnell mit ROS reagieren, um mit Antioxidantien konkurrieren zu können. Eine der genauesten Methoden, um ROS zu identifizieren, ist die Elektronen-Spin-Resonanz (ESR)-Spektroskopie, welche in Rahmen dieser Arbeit speziell für die ROS/RNS-Detektion im kardiopulmonalen System etabliert wurde.Der Schwerpunkt des ersten Teils der Arbeit lag auf der Untersuchung der Auswirkungen von Hypoxie-induziertem oxidativen Stress auf pulmonale Zellen zur Aufklärung (patho-)physiologischer Mechanismen der hypoxisch pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) primär anhand von in vitro Modellen. Ergänzend dazu wurde ein zunächst eher messtechnisch ausgerichteter Pilotversuch an einer isolierten, ventilierten und perfundierten Mauslunge (ILU) durchgeführt. Neben dem ESR-Signal wurden hierbei unter anderem auch Daten zum Verlauf des pulmonal-arteriellen Drucks in Form einer hochaufgelösten Zeitreihe erfasst.Das Ziel der klinischen Studie im zweiten Teil war, einen möglichen Zusammenhang zwischen einer histopathologisch bestimmten akuten Abstoßungsreaktion des Lungentransplantats und der mittels ESR-Spektroskopie detektierten Superoxid-Konzentration in der BAL-Flüssigkeit von lungentransplantierten Patienten zu untersuchen. Aufgrund der Variabilität der Klassifikation der Biopsien sowie der großen Heterogenität der Studienpopulation wurde nicht allein auf die Superoxid-Konzentration als potentieller diagnostischer Marker fokussiert, sondern auch Routinelabor-Parameter wie die Zusammensetzung der Leukozytenpopulationen, Kontamination der Probe durch Blut oder auch der Hämosiderin-Score betrachtet.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten folgende Schlussfolgerungen zu:i. Die ESR-Spektroskopie ist eine sensitive Methode zum Nachweis von ROS/ RNS in in vitro Modellen sowie der BAL-Flüssigkeit von lungentransplantierten Patienten.ii. Zur Untersuchung der Beziehung zwischen Hypoxie, ROS und HPV wurden hochaufgelöste Zeitreihen mittels ESR-gestützten ILU-Experimenten durchgeführt. Um den physiologischen den ROS-Anteil am ESR-Signal zu bestimmen, stellen sich besondere Anforderungen an die Durchführung und Analyse, da das ESR-Signal durch die O2-Konzentration im Perfusat zu stark beeinflusst wird. Neben der Einschaltung eines Degassers in die Probenschleife wird die direkte Messung des pO2 und eine daran anschließende Modellierung der rein durch wechselnde O2-Partialdrucke bedingten ESR-Transienten als notwendig angesehen.iii. Die Antwort pulmonal-arterieller Zellen auf Hypoxie ist komplex. Abhängig vom Zelltyp, der Zellzahl, Intensität und Dauer der Hypoxieexposition konnte eine ansteigende oder abfallende ROS-Bildung nachgewiesen werden. Unter akuter Hypoxie reagierten murine Lungenfibroblasten (MLF) auf fallende O2-Konzentrationen mit einem kontinuierlichen Absinken der Superoxid-Konzentration, während die von murine pulmonal-arterielle glatte Muskelzellen (PASMC) bei 1% O2 gegenüber 5, 10, 15 und 21% O2 signifikant erhöht war. Mit zunehmender Hypoxiedauer fiel die Superoxid-Produktion jedoch stark ab. Unter chronischer Hypoxie war bei PASMC kaum noch Superoxid nachweisbar.iv. Unter Normoxie (21% O2) konnte darüber hinaus bei PASMCs eine negative Korrelation zwischen freigesetztem Superoxid und der Zellpassage festgestellt werden. Ebenfalls negativ zueinander korrelliert waren die ermittelten Intensitäten zwischen ESR- und DCFDA-Methode, was auf eine Homöostase zwischen Superoxid und Peroxinitrit auf der einen und Hydrogenperoxid auf der anderen Seite hinweist.v. Im Kontext einer klinischen Studie bei 78 lungentransplantierten Patienten wurde anhand von 238 histopathologisch sowohl nach ISHLT-A als auch ISHLT-B eingestuften Biopsien erstmals die mittels ESR gemessene Superoxid-Konzentration in der BAL-Flüssigkeit als möglicher Biomarker einer akuten Transplantatabstoßung größer gleich A2 oder B2 etabliert. Außerdem konnte der Anteil an Neutrophilen und Makrophagen als Prädiktoren einer schweren Abstoßung identifiziert werden. Darüber hinaus ergaben sich signifikante Hinweise auf das Bestehen geschlechtsabhängiger Unterschiede.