Untersuchungen zum Vorkommen von Mutationen in den Nichtstrukturproteingenen 3c und 7b des felinen Coronavirus bei spontanen FIP-Fällen

Abstract

Ziel der Arbeit war es, mittels RT-PCR und anschließender Sequenzierung zu überprüfen, welche Rolle Deletionen oder andere Mutationen im Nichtstrukturproteingen 3c des FCoV bei an FIP erkrankten Katzen spielen. Darüber hinaus wurde auch eine Amplifikation des Nichtstrukturproteingens 7b durchgeführt.2. In der Literaturübersicht wird zunächst ein Überblick über die bisherigen Vorstellungen zur Pathogenese der FIP beschrieben. Dabei steht das Genom der felinen Coronaviren im Mittelpunkt der Betrachtung. Auf bisherige Vorstellungen zur Bedeutung des Vorkommens von Deletionen in den Nichtstrukturproteingenen wird in besonderem Maß eingegangen. 3. Die RNA-Isolierung mit anschließender RT-PCR erfolgte aus 282 Gewebeproben von insgesamt 28 Katzen, bei denen in der Sektion sowie histopathologisch und immunhistologisch FIP diagnostiziert wurde. Mithilfe veröffentlichter FCoV-Stämme wurden Primer für die entsprechenden Positionen hergestellt und die optimalen PCR-Bedingungen anhand bereits isolierter FCoV-RNA aus dem Institut für Virologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, ermittelt.4. Es stellte sich heraus, dass die Amplifikation des Nichtstrukturproteingens 7b wesentlich effektiver gelang als die von 3c. Für die Amplifikation von ORF 3c musste deshalb ein nested PCR-Verfahren eingesetzt werden. Insgesamt war der Nachweis beider Nichtstrukturproteingene aus dem großen Netz (Omentum maius) und dem Mesenteriallymphknoten häufiger möglich als aus anderen Organen. 5. Die Sequenzanalyse ergab, dass innerhalb einer Katze der Großteil der Isolate verschiedener Gewebe identisch war. Sowohl bei ORF 3c als auch ORF 7b fanden sich bei einzelnen Katzen die größten Abweichungen von den restlichen Geweben in den Darmisolaten. Deletionen innerhalb von ORF 3c konnten bei 11/19 Katzen mit vollständig vorliegenden Sequenzdaten gefunden werden. Darüber hinaus traten in 14/19 Fällen Stopcodons in der Basensequenz von 3c auf. Von den insgesamt 26 Katzen mit Sequenzdaten zu ORF 7b fanden sich nur in einem Fall Deletionen innerhalb des Gens. Allerdings zeigten sich hier durchgehende Aminosäurekodierungen ohne Stopcodons. 6. In dieser Arbeit konnte das gehäufte Auftreten von Deletionen im Nichtstrukturproteingen 3c bei FIPV bestätigt werden. Außerdem traten bei FIPV im Gegensatz zu den als FECV deklarierten Sequenzen häufig Stopcodons innerhalb der Basensequenz auf. Jedoch wiesen nicht alle untersuchten FIP-Katzen Deletionen im Nichtstrukturproteingen 3c auf und bei 3 dieser Tiere lagen auch durchgehende und vollständige Aminosäurekodierungen vor. Deshalb können Mutationen des 3c-Gens nicht zwangsläufig mit der Virulenz des FCoV gekoppelt werden. 7. Das Auftreten von Mutationen in ORF 3c war unabhängig vom untersuchten Gewebe. Außerdem konnte kein Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Mutationen/Stopcodons und dem Geschlecht der Katzen, den pathologisch-anatomischen Befunden sowie dem immunhistologischen Signal festgestellt werden. Der FCoV-Nachweis gelang auch aus Geweben ohne pathologisch-anatomische und histopathologische Veränderungen, was die Vermutung nahelegt, Virus aus dem Blut der entsprechenden Organe isoliert zu haben.8. Die erfolgreichere Amplifikation von ORF 7b im Vergleich zu ORF 3c kann auf unterschiedliche Mengen an subgenomischer mRNA in infizierten Zellen zurückzuführen sein. Eine Bedeutung und ein beteiligter Regulationsmechanismus hierfür sind bislang nicht bekannt. 9. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit hängt der Ausbruch von FIP bei einer FCoV-infizierten Katze nicht zwangsläufig mit Deletionen oder Mutationen in den Nichtstrukturproteingenen 3c und 7b zusammen.

The aim of this study was to investigate the role of potential deletions or other mutations in nonstructural protein gene 3c of FCoV in FIP-affected cats by using RT-PCR and sequencing. Furthermore, an amplification of the nonstructural protein gene 7b was performed. 2. First, an overview on actual knowledge about the pathogenesis of FIP is described with a focus on feline coronavirus genome. In particular, the significance of deletions in FCoV nonstructural protein genes is discussed. 3. RNA isolation and RT-PCR were carried out using 282 tissue specimens of 28 cats diagnosed with FIP at necropsy as well as in histopathology and immunohistochemistry. Primers were designed according to published sequences of FCoV strains. PCR protocols were tested using purified FCoV RNA provided by the Department of Virology, University of Giessen. 4. Amplification of the nonstructural protein gene 7b was more effective than that of 3c. For the latter, nested PCR was needed for successful amplification of ORF 3c. Comparing to the other investigated tissues, the two nonstructural protein genes could be detected more frequently in the omentum and the mesenteric lymph node, respectively. 5. Within one cat, sequences isolated from different organs were very similar or most often identical. Most discrepancies were found between the intestinal and the other isolates of both studied nonstructural protein genes. Deletions in 3c genes were obvious in 11/19 cats with complete sequence data. In 14/19 cases stop codons in the sequence of ORF 3c occurred. Sequencing of ORF 7b revealed deletions in only one cat. None of the 7b sequences showed internal stop codons.6. As described in prior studies, a high rate of deletions in nonstructural protein gene 3c in FIPV could be observed. Additionally, internal stop codons were even more frequent in FIPV whereas the investigated FECV all had intact 3c sequences. But not all of the FIP cats 3c genes had deletions or were affected by truncated amino acid sequences. Thus, 3c gene or protein integrity is not necessarily correlated with low virulence. 7. Mutations in ORF 3c occurred in strains isolated from different organ systems, independent from the affected tissue. In addition, there was no association between mutations/stop codons and the cats gender, type of gross lesions or the occurrence of an immunohistochemical signal. Detection of FCoV was possible in tissues without any gross or histopathological alterations. So it is hypothesized that in these cases virus was isolated from the blood. 8. Possibly, the more effective amplification of ORF 7b compared to ORF 3c might be due to unequal amounts of subgenomic mRNA in infected cells. The meaning and the involved regulatory mechanism of this phenomenon are unknown. 9. An outbreak of FIP in FCoV-infected cats is not necessarily associated with deletions or other mutations in the nonstructural protein genes 3c and 7b.