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Untersuchungen zur Pathogenese der Felinen Infekti├Âsen Peritonitis mittels reverser Genetik

Spies, Danica


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-92035
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2013/9203/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Felines Coronavirus , FIP , revers-genetisches System , Monozyten
Universität Justus-Liebig-Universit├Ąt Gie├čen
Institut: Institut f├╝r Virologie des Fachbereichs Veterin├Ąrmedizin
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m├╝ndlichen Pr├╝fung: 11.02.2013
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 18.02.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Feline Coronaviren (FcoV) gelten als wichtige Forschungsobjekte, weil sie sowohl bei domestizierten als auch bei wildlebenden Feliden eine t├Âdlich verlaufende Krankheit, die feline infekti├Âse Peritonitis (FIP) verursachen. Nach vorherrschender Meinung entsteht das verursachende Virus im Verlauf einer persistierenden Infektion mit einem relativ harmlosen felinen enteralen Coronavirus (FECV). Demnach f├╝hren Mutationen von FECV zur Entstehung des t├Âdlichen FIP-Virus. Die Pathogenese der FIP ist allerdings weitgehend unbekannt. F├╝r die Untersuchung der Pathogenese wurde ein revers-genetisches System f├╝r Serotyp II FcoV etabliert. Daf├╝r wurde eine genomlange cDNA Kopie des FCoV Serotyp II Genoms in das Vaccinia Virus Genom integriert. Mittels Vaccinia Virus vermittelter homologer Rekombination wurden in mehreren Schritten einzelne Bereiche in einem bestehenden Serotyp I Konstrukt durch die korrespondierenden Serotyp II Sequenzen ausgetauscht. Der Vaccinia Virus-Vektor diente als Ausgangspunkt f├╝r die in vitro Synthese einer infekti├Âsen genomischen RNA mit einer Gr├Â├če von 30 Kilobasen. Hinsichtlich Wachstumskinetik und Plaquemorphologie bestand kein Unterschied zwischen dem rekombinanten Virus und dem Ausgangsvirus. Zudem f├╝hrten beide Viren in einem Tierversuch zu FIP. Das FCoV-Genom aus den an FIP erkrankten Tieren wurde komplett sequenziert und die erhaltenen Sequenzen mit den Input-Virus-Sequenzen verglichen. Bei dem Vergleich wurden interessante Mutationen detektiert; ein Nukleotidaustausch fand in dem Gen S und ein weiterer im Gen 3c statt, der zur Wiederherstellung des ORF 3c f├╝hrt. Mit Hilfe des revers-genetischen Systems wurden anschlie├čend rekombinante FCoV hergestellt, die diese Mutationen einzeln und in Kombination aufwiesen. F├╝r die Analyse der Treffzellen von FCoV wurde ein rekombinantes GFP-exprimierendes Serotyp II FCoV hergestellt, das anstatt der akzessorischen Gene 3abc das Reportergen GFP stabil exprimiert. Infektionsstudien mit felinen Blutzellen best├Ątigten Daten aus der Literatur, wonach lediglich Monozyten/Makrophagen als Treffzellen f├╝r FCoV dienen. Die Replikation in diesen Zellen sowie der Prozentsatz an infizierten Zellen nahmen zu, wenn die Infektion erst eine Woche nach Kultivierung der Blutzellen erfolgte. Um FCoV als Vektor f├╝r die Impfstoffherstellung einzusetzen, wurden rekombinante Serotyp I FCoV generiert, die calicivirale Strukturgene anstelle der Gene 3abc bzw. 7ab besa├čen. An beiden Positionen im FCoV-Genom fand keine stabile heterologe Expression statt; gro├če Teile der Fremdgene wurden deletiert. Die Stabilit├Ąt des heterologen Gens wird beeinflusst vom coronaviralen Hintergrund, vom jeweiligen Fremdgen und von der Position im FCoV-Genom.
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