Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Influence of inflammatory stimuli on the peroxisomal compartment of mouse macrophages

Kollas, Andreas


Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.822 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-123794
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12379/

Bookmark bei del.icio.us


Freie Schlagwörter (Deutsch): Peroxisome , Makrophagen , Atherosklerose , Entzündung
Freie Schlagwörter (Englisch): peroxisome , macrophage , atherosclerosis , inflammation
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie, Abteilung medizinische Zellbiologie II
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2016
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 13.12.2016
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden alle Methoden etabliert, um Peroxisomen in Makrophagen zu untersuchen. Die Aktivierung der Makrophagen wurde durch Inkubation mit LPS bzw. mit oxLDL ausgelöst. Darüber hinaus wurden LPS-induzierte Effekte in Makrophagen mit defekten Peroxisomen untersucht.
Die Etablierung eines optimalem Protokolls zur subzellularen Fraktionierung und Isolierung einer angereicherten Peroxisomenfraktion mit Hilfe von differentieller Zentrifugation erbrachte, dass Einfrieren der Zellproben bessere Ergebnisse bei der Homogenisierung lieferte und notwendig war, um eine ideale Anreicherung der Peroxisomen zu erzielen. Nur durch die Verwendung der angereicherten Peroxisomenfraktion konnten auch peroxisomale Enzyme analysiert werden, die nur in geringer Menge exprimiert werden, wie z.B. die peroxisomale Thiolase. Während der Etablierung eines optimalen Protokolls zur Langzeitinkubation der Makrophagen mit LPS zeigte sich, dass die Zugabe von Serum ins Inkubationsmedium essentiell notwendig war, um das Überleben der Zellen zu sichern. Des weiteren beeinträchtigte die Verwendung von serumfreiem Medium, wie sie in der Literatur angegeben wird, die Peroxisomenaktivität.
RT-PCR und Western Blot-Analysen sowie Immunofluoreszenz-Studien erbrachten tiefgreifende Veränderungen des peroxisomalen Kompartments nach LPS Behandlung. Nach 24 h wurde die Genexpression von beta-Oxidationsenzymen, der H2O2 abbauende Katalase und des peroxisomalen Biogeneseproteins PEX11alpha drastisch reduziert. Dagegen war die Expression des PEX13 Gens kaum und die des PEX14 nicht beeinflusst. Da die LPS Behandlung PEX14 nicht beeinträchtigte, wurde ein Antikörper gegen Pex14p als idealer Marker zum Nachweis der Peroxisomen nach LPS-Behandlung verwendet. Versuche - basierend auf Immunofluoreszenzfärbungen von peroxisomalen Proteinen zum Nachweis des Organells - ergaben, dass sich die Peroxisomenanzahl nach Langzeitbehandlung mit LPS (>=48 h) signifikant vermehrte. Zudem ging der Peroxisomenproliferation ein Anstieg der Pex11alpha-Genexpression voraus und die Proteinspiegel von peroxisomalen
beta-Oxidationsenzymen und Katalase wurden weitgehend wiederhergestellt. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle des peroxisomalen Metabolismus in der Auflösung inflammatorischer Prozesse in Makrophagen hin. Weiterführend wurden die zugrunde liegenden Signalwege untersucht. Verwendet wurden spezifische Inhibitoren gegen TLR-4, NFkappaB sowie TNF-R. Die Ergebnisse zeigten, dass die peroxisomale Reaktion auf die LPS-Behandlung durch den TLR-4/NFkappaB Signalweg sowie durch TNF-R, insbesondere in frühen Zeitpunkten, vermittelt wurden.
Die Behandlung von Makrohagen mit oxidiertem LDL (oxLDL) zeigte entgegengesetzte Effekte wie die LPS-Behandlung. Eine Western Blot-Analyse erbrachte erhöhte Proteinmengen an Katalase sowie Thiolase. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das peroxisomale Kompartment in Makrophagen während der Beseitigung von intimalem oxLDL aktiviert wird. Damit könnte der Schutz von Makrophagen vor Lipotoxizität und oxidativen Stress verbunden sein, um die Schaumzellbildung zu verhindern.
Zuletzt konzentrierten sich die Versuche auf den Einfluss einer peroxisomalen Dysfunktion auf die LPS indizierte Makrophagenaktivierung. Dazu wurden Makrophagen aus PEX11alpha KO Mäusen isoliert, da sich gezeigt hatte, dass die PEX11alpha -Expression stark von der LPS-Behandlung beinflusst wird. Tatsächlich wurden in PEX11alpha KO Makrophagen ein erhöhter Zelltod und die Aktivierung von Caspase-3 beobachtet, verbunden mit einer erhöhten Bad mRNA-Expression in KO-Makrophagen, was darauf hindeutet, dass der intrisiche mitochondriale Apoptoseweg vermehrt induziert ist. Des Weiteren traten geschlechtsspezifische Unterschiede in der Reaktion auf LPS-Behandlung auf, was sich durch eine stärkeren Expression pro-inflammatorischer Marker in Makrophagen von weiblichen PEX11alpha KO Mäusen äußerte.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Peroxisomen in Makrophagen wichtige Funktionen während der Aktivierung von Makrophagen durch verschiedene Stimuli wahrnehmen. Wie durch Versuche an PEX11alpha -KO-Mäusen gezeigt wurde, verändert die peroxisomale Dysfunktion die Expression pro-inflammatorischer Marker und könnte zur Verlängerung oder zur Chronifizierung inflammatorischer Prozesse führen. Daher erfüllt der peroxisomale Metabolismus wichtige Funktionen im Schutz von Makrophagen vor frühzeitigem Zelltod während ihrer Aktivierung und der Pathogenabwehr. Der hier beobachtete Effekt könnte Teil eines generellen Schutzmechanismus in Makrophagen sein. Daher ist es wahrscheinlich, dass Peroxisomen ebenfalls bei chronischen Entzündungskrankheiten wie Leberzirrhose, neurodegenerativer Erkrankungen, z.B. Alzheier, oder Atherosklerose, eine Rolle spielen.
Kurzfassung auf Englisch: Macrophages are, as part of the innate immune system, at the first line of defense against invading pathogens and intrinsic inflammatory factors. Although it is known that macrophages contain peroxisomes which fulfill important functions in cell metabolism, e.g. ROS degradation or lipid metabolism, before the beginning of this thesis, nothing was known about the role of peroxisomes in macrophages.
In this thesis, all methods available were established to study peroxisomes in macrophages. Pro-inflammatory reactions were induced by LPS or oxidized LDL. Moreover, LPS-mediated effects on macrophages were characterized under conditions of peroxisomal dysfunction.
Establishment of an optimal protocol for subcellular fractionation by differential centrifugation for the isolation of enriched peroxisomal fractions revealed that freezing of the macrophage cell samples was beneficial for the homogenization procedure and necessary for the best peroxisome recovery. Only these enriched peroxisome fractions enable the study of less abundant peroxisomal metabolic proteins, such as the peroxisomal thiolase. Moreover, during the establishment of an optimal protocol for long term LPS treatment, it was noted, that serum addition to the incubation medium was essential for macrophage long-term survival. Serum-free incubation, as generally used in the literature, exerted negative effects on cell survival and the peroxisomal compartment.
After LPS treatment, RT-PCR and Western blot analyses as well as immunoflourescence studies with antibodies against POL proteins revealed tremendous changes in the peroxisomal compartment and related genes. Up to 24 h beta-oxidation enzymes, the H2O2 degrading catalase as well as the peroxisomal biogenesis protein PEX11alpha were strongly reduced. In contrast, the PEX13 gene was hardly influenced and PEX14 not altered at all. Since Pex14p was not changed, an antibody against this protein was used as an ideal marker to identify peroxisomes after LPS treatment. Immunofluorescence-based studies on peroxisome morphology revealed a significant increase in numerical abundance of peroxisomes after long-term LPS incubation (> 48 h). Moreover, increased PEX11alpha induction preceded the peroxisomal proliferation and the protein levels of catalase as well as beta-oxidation enzymes were almost reconstituted at late incubation times. This suggests an important role of peroxisomal metabolism in the resolution of inflammatory processes in macrophages. Furthermore, the underlying signaling pathway was investigated with specific inhibitors against TLR-4, NFkappaB and TNF-R1/2. The results revealed that the peroxisomal response was mediated by the TLR-4/NFkappaB pathway, as well as the TNF-R pathway in the early phase of LPS-treatment.
Incubation of macrophages with oxidized LDL (oxLDL) induced opposite effects on the peroxisomal compartment of macrophages, increasing protein levels of catalase and thiolase. This suggests that the peroxisomal compartment in macrophages is activated during clearing of oxidized lipids and would lead to cell protection against oxLDL-mediated lipotoxicity and oxidative stress, possibly preventing or retarding foam cell formation during the development of atherosclerosis.
Finally, experiments focused on LPS-induced effects under peroxisomal dysfunction conditions in primary macrophages of Pex11alpha knockout mice, since this gene was severely affected in distinct phases of LPS-treatment. Indeed increased macrophage cell death and activation of caspase-3 was observed, accompanied by increase of Bad mRNA expression, suggesting an activation of the intrinsic mitochondrial apoptosis pathway. Moreover, sex-specific differences in expression of pro-inflammatory marker genes were noted under steady-state conditions as well as under LPS-stimulation, revealing a stronger reaction of macrophages isolated from female mice.
Taken together, the results of this thesis indicate that peroxisomes are abundant in macrophages and fulfill important metabolic tasks during macrophage activation by distinct pro-inflammatory stimuli. As shown in Pex11alpha gene KO experiments, peroxisomal dysfunction severely alters pro-inflammatory mediators and might lead to prolongation or chronification of inflammatory processes. In this respect, peroxisomal metabolic pathways play an important role for the protection of macrophages against cell death during activation and anti-pathogenic response and the resolution of inflammatory processes. Since the observed effects seemed to be part of a general defense mechanism in macrophages, it is likely, that peroxisomes play also a role in a variety of chronic inflammatory diseases, such as liver cirrhosis, neuro-degenerative diseases like Alzheimer’s disease or atherosclerosis.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand