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Das neuronale Differenzierungspotenzial von caninen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe

Blecker, Daniela


Originalveröffentlichung: (2016) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (12.598 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-123730
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12373/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6503-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 12.12.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem neuronalen Differenzierungspotenzial caniner mesenchymaler Stammzellen aus dem Fettgewebe. Ziel der Arbeit war es, canine ASCs zunächst näher zu charakterisieren und anschließend ihre Fähigkeit, neuronal zu differenzieren, zu untersuchen. Hierfür wurden Stammzellen aus dem Fettgwebe von neun Hunden in undifferenziertem Zustand zunächst auf ihre Differenzierungsfähigkeit und ihre Expressionsmuster charakterisiert. Diese Zellen ließen sich in eine adipogene, chondrogene und osteogene Linie differenzieren. Des Weiteren waren sie positiv für die Expression der Zelloberflächenmarker CD90 und CD105. Aufgrund dessen konnten sie als Stammzellen identifiziert und für die weiteren Versuche verwendet weden. In in vitro Untersuchungen wurden die Zellen mithilfe eines neuronalen Induktionsmediums, bestehend aus Insulin, Forskolin, Kaliumchlorid, Butylhydroxyanisol, Valproinsäure und Hydrocortison, neuronal differenziert. Weitere Analysen der Zellen wurden zu den Zeitpunkten 3h, 24h und 72h nach Differenzierungsinduktion durchgeführt. Nicht differenzierte Zellen dienten hierbei als negativ-Kontrollgruppe. Canines Hirngewebe diente als Positivkontrolle.
Anhand von lichtmikroskopischen Untersuchungen konnte eine veränderte Morphologie der Zellen bereits nach einer Stunde Differenzierung festgestellt werden. Dabei zog sich das Zytoplasma in Richtung des Somas zusammen und bildete mehrere, zunächst primär, später auch sekundär und tertiär verzweigte Ausläufer aus. Neben der morphologischen Untersuchung erfolgte die Analyse der Genexpression neuronaler und glialer Marker. Dieser Nachweis wurde mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Untersucht wurden hierbei die Expressionsmuster der neuronalen Marker ß-III-Tubulin, MAP2, Nestin und des glialen Markers GFAP. Ebenso erfolgte die Auswertung der Expression der Neurotrophine NGF, BDNF und GDNF. Dabei fiel auf, dass cASCs bereits in einem undifferenzierten Zustand neuronale Marker sowie alle untersuchten Neurotrophine exprimierten. Lediglich GFAP konnte weder in undifferenzierten noch in differenzierten cASCs nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Expression alle Marker, auch eine GFAP-Expression, im caninen Hirngewebe demonstriert werden. In neuronal differenzierten Zellen zeigte sich im Differenzierungsverlauf eine veränderte Expression der Marker. Das Expressionsmuster von MAP2 stieg im Laufe der Differenzierung signifikant an. Die Expression von BDNF und GDNF stieg ebenfalls an, allerdings weniger deutlich als MAP2. NGF wurde hingegen 24h nach neuronaler Differenzierung signifikant niedriger exprimiert als nach 3h Differenzierung. Ebenso sank die Expression der Marker Nestin und ß-III-Tubulin 24h nach Induktionsbeginn signifikant ab. Mittels Immunhistochemie konnten MAP2, Nestin, ß-III-Tubulin, GFAP und A2B5 positiv in differenzierten sowie undifferenzierten Zellen nachgewiesen werden. Anhand des Western Blots konnte gezeigt werden, dass sich nicht nur die mRNA in den Zellen verändert, sondern dass auch neurale Proteine innerhalb der differenzierten Zellen translatiert werden.
Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass sich canine ASCs durch eine neuronale Induktion neuronal differenzieren lassen und eine Neuronen-ähnliche Morphologie, sowie veränderte Gen- und Proteinexpressionen aufzeigen. Somit bietet diese Erkenntnis Anlass zu einer weiteren Erforschung der neuronalen Differenzierung von caninen Stammzellen aus dem Fettgewebe für einen künftigen Einsatz in der Veterinär- und Humanmedizin.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the study was to investigate the neuronal differentiation potential of canine adipose derived stem cells. For this objective, stem cells obtained from the adipose tissue of nine dogs have been isolated and cultured. First, these cells were characterized by their differentiation capacitiy to differentiate in adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages and by their positive genexpression for the surface markers CD90 and CD105. Basend on these results, the isolated cells could be defined as mesenchymal stem cells. In further in vitro investigations, cells were differentiated with a neuronal induction medium, consisting of insulin, forskolin, potassium chloride, butylhydroxyanisole, valproic acid and hydrocortisone. Additional analyses were conducted 3h, 24h and 72h after neuronal induction. Control groups consisted of undifferentiated cells of the same donor animals. Dog brain tissue acted as main positive control. Based on microscopic analyses, morphological changes of the cells could already be noticed one hour after neuronal induction. During neuronal differentiation, cell bodies became increasingly spherical and refractile, exhibiting a typical neuronal perikaryal appearance. Processes continued to elaborate, displaying primary, secondary and at least tertiary branches and putative filopodial extensions. To further characterize neuronal differentiation, gene expression of neuronal and glial markers was analysed by quantitative polymerase chain reaction. For this, expression patterns of the neuronal genes ß-III-tubulin, MAP2, nestin and the glial gene GFAP were investigated. In addition, expression of the neurotrophic factors NGF, BDNF and GDNF was determined. Thereby it could be noticed that neural markers and neurotrophic factors were already expressed in undifferentiated cASCs. Only expression of GFAP could not be demonstrated neither in differentiated nor in undifferentiated cells. Indeed, canine brain tissue was positive for all investigated markers, including GFAP. During the differentiation process neural differentiated cASCs showed a changed marker expression. The expression pattern of MAP2 increased significantly from 3h to 72h. Expression of BDNF and GDNF increased too, but there were no significant differences between the investigated timepoints. NGF expression decreased during neuronal differentiation likewise the markers nestin and ß-III-tubulin. By immunocytochemistry, cells showed a positive expression for GFAP, MAP2, ß-III-tubulin, nestin and A2B5 independently wether they were differentiated or not. Based on western blot analysis, even protein translation could be demonstrated for neuronal differentiated cASCs.
The obtained findings show the neuronal differentiation potential of canine adipose derived stem cells as proved by changed neuron-like morphology and altered genexpression. These results suggest further investigation of the neuronal differentiation potential of cASCs for a prospective application in veterinary and human medicine.
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