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Redox regulation of Plasmodium falciparum methionine adenosyltransferase and Mycetinis scorodonius DyP-type peroxidase 1

Pretzel, Jette


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-122976
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12297/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Plasmodium falciparum , Methioninadenosyltransferase , Redoxregulation , Glutathionylierung , Dye-decolorizing Peroxidase
Freie Schlagwörter (Englisch): Plasmodium falciparum , methionine adenosyltransferase , redox regulation , glutathionylation , Dye-decolorizing peroxidase
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Professur für Biochemie und Molekularbiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.10.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 01.11.2016
Kurzfassung auf Englisch: Changes in the redox state of protein cysteines in response to dynamic alterations of the cellular redox state modulate the activity and structure of proteins. Therefore, several vital cellular processes are redox regulated, including nitric oxide production, apoptosis, immune response, and signaling processes. The aim of this dissertation was to characterize in detail the redox regulation of two target proteins: methionine adenosyltransferase of the malaria parasite Plasmodium falciparum (PfalMAT) and the dye-decolorizing peroxidase 1 of the fungus Mycetinis scorodonius (MscDyP1).
PfalMAT is an attractive drug target since its product, S-adenosylmethionine, is the major biochemical methyl group donor and a precursor for crucial downstream pathways such as polyamine metabolism. However, PfalMAT has so far been poorly characterized. This dissertation provides a detailed kinetic analysis, including inhibitor and oligomerization studies to expand the biochemical characterization of this enzyme. Furthermore, the dimeric human homolog hMATIII was characterized here using the same assay system to allow a direct comparison of both enzymes. A second aim of this dissertation was to characterize the interplay of PfalMAT with the plasmodial redoxins thioredoxin-1, glutaredoxin, and plasmoredoxin, as well as to study in detail the impact of the thiol-based post-translational modifications S-glutathionylation and S-nitrosylation on the activity and oligomerization of PfalMAT. In order to identify potential sites of these redox modifications in PfalMAT a homology model was created, which indicated that among the eight cysteines of PfalMAT, Cys52, Cys113, and Cys187 were solvent accessible in the dimeric enzyme. Hence, these cysteines were conservatively mutated via site-directed mutagenesis into serines, and their kinetic and oligomerization behaviors were studied using a spectrophotometric assay and gel filtration experiments, respectively. PfalMAT activity was indeed affected by redox regulatory processes; reduction of cysteines by the reducing agent dithiothreitol and reduced glutathione activated PfalMAT, whereas enzyme inhibition followed oxidative events, i.e. S-glutathionylation and S-nitrosylation. Consequently, the impact of the selected cysteines on these redox regulatory processes was studied, showing that thioredoxin 1 and plasmoredoxin potently activated PfalMAT at subcellular concentrations by specifically changing the oxidation state of Cys52 and Cys113, whereas glutaredoxin did not alter PfalMAT activity. Protein-S-glutathionylation inhibited PfalMAT via a thiol-disulfide exchange between glutathione disulfide and Cys113. Deglutathionylation was mediated by thioredoxin 1 and plasmoredoxin, which restored the activity of PfalMAT at physiological concentrations, suggesting a likely in vivo regulation. Furthermore, PfalMAT was inhibited upon S-nitrosylation of Cys52, Cys113, and Cys187 under NO-stress. These results indicate a coupling of the S-adenosylmethionine status to the cellular redox state of P. falciparum via redox regulation of PfalMAT.
The second enzyme on focus of this dissertation, was MscDyP1. This dye-decolorizing peroxidase (DypPrx) is a member of the recently identified eponymous novel class of heme peroxidases, which differ structurally and mechanistically from classic heme peroxidases. Within this dissertation, upon systematic screening and optimization of different crystallization conditions, high resolution protein crystals of MscDyP1 were obtained, that allowed to solve the three-dimensional structure of MscDyP1. This structure revealed interesting features. Two surface-exposed methionine residues, Met302 and Met305, which are not conserved among DypPrx, appeared to play an important structural role, confirmed by site-directed mutagenesis. Furthermore, the single conserved cysteine,Cys360, is connected to the fifth proximal coordination partner of the heme iron, thus contributing to the formation of the active site. Cys360 accessible to small redox-active molecules indicating a redox regulation of MscDyP1 might be possible. Site-directed mutagenesis studies using a recombinant enzmye heteroogously overexpressed in E. coli revealed adverse effect on activity, substrate affinity to hydrogen peroxide. And a higher resistance to suicide inhibition upon high hydrogen peroxide concentrations upon a lack of Cys360, indicating Cys360 participates in the regulation of MscDyP1 via redox processes in vitro. The native enzyme is highly glycosylated, which was shown to protect Cys360 from oxidative effects, indicating redox regulation of MscDyP1 is rather unlikely in vivo.
Kurzfassung auf Deutsch: Veränderungen des zellulären Redoxmillieus gehen mit Änderungen des Redoxstatus von Cysteinen zellulärer Proteine einher. Dies hat Auswirkungen auf ihre Aktivität und Struktur. Die Redoxregulation von Proteinen spielt deshalb eine wichtige Rolle in vielen lebenswichtigen zellulären Prozessen, wie Apoptose, Signaltransduktion oder Immunreaktionen. Im Fokus dieser Dissertation stand die Untersuchung der Redoxregulation von zwei Zielproteinen: Der Methioninadenosyltransferase des Malariaparasiten Plasmodium falciparum (PfalMAT) und der DyP-Peroxidase 1 (Dye-decolorizing) des Basidiomyceten Mycetinis scorodonius (MscDyP1). PfalMAT stellt ein attraktives Ziel für die Medikamentenentwicklung dar. Aufgrund seiner hohen Wachstums- und Teilungsrate, ist der Malariaparasit in besonderem Maße abhängig von der S-Adenosylmethioninproduktion, da dieses, als wichtigster Methylgruppendonor der Zelle, eine Vorstufe für lebenswichtige Stoffwechselwege und zelluläre Prozesse, wie den Polyaminstoffwechsel, darstellt. Das S-Adenosylmethionin-synthetisierende Enzym, PfalMAT, ist bisher nur unzureichend untersucht. Die vorliegende Dissertation erweitert das biochemische Verständnis für dieses Enzym durch detaillierte kinetische Analysen und Inhibitorstudien. Darüber hinaus wurde PfalMAT mit dem dimeren humanen Homolog hMATIII verglichen. Ein weiteres Ziel dieser Dissertation war es die Interaktion der plasmodialen Redoxine Thioredoxin 1, Glutaredoxin und Plasmoredoxin mit PfalMAT sowie den Einfluss der Thiol-basierten posttranslationalen Modifikationen S-Glutathionylierung und S-Nitrosylierung im Hinblick auf Aktivität und Konformation von PfalMAT zu charakterisieren. Um die redox-modifizierbaren Thiole zu identifizieren wurde ein Homologiemodell von PfalMAT erstellt, das vermuten ließ, dass von den acht Cysteinen von PfalMAT Cys52, Cys113 und Cys187 in der dimeren Konformation des Enzyms für redox-aktive Moleküle zugänglich sind. Darum wurden diese Cysteine durch gerichtete Mutagenese zu Serinen mutiert. Die entsprechenden Mutanten wurden mit Hilfe eines spektrophotometrischen Assays kinetisch charakterisiert und ihre Oligomerisierung wurde in Gelfiltrationsexperimenten untersucht. PfalMAT wurde redoxreguliert, dabei führten Reduktion durch Glutathion und Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol, zur Aktivierung und Oxidationsvorgänge, wie S-Glutathionylierung und S-Nitrosylierung zur Inhibierung von PfalMAT. Subzelluläre Konzentrationen an Thioredoxin 1 und Plasmoredoxin erhöhten die enzymatische Aktivität von PfalMAT, ein Effekt, der auf eine spezifische Reduktion von Cys52 und Cys113 zurückgeführt werden konnte. Protein-S-Glutathionylierung inhibierte PfalMAT durch einen Thiol-Disulfidaustausch zwischen Glutathiondisulfid und Cys113, wobei die S-Glutathionylierung durch den Zusatz von Thioredoxin 1 und Plasmoredoxin in physiologischen Konzentrationen vollständig reversibel war. S-Nitrosylierung inhibierte PfalMAT durch die Modifikation von Cys52, Cys113 und Cys187. Diese Ergebnisse deuten auf eine Kopplung des S-Adenosylmethioninspiegels an den zellulären Redoxstatus von P. falciparum hin, die über die Redoxregulation von PfalMAT vermittelt wird.
Das zweite Enzym, das im Fokus dieser Dissertation stand, war MscDyP1. Diese DyP-type Peroxidase zählt zu einer erst kürzlich entdeckten Klasse von Hämperoxidasen, die sich strukturell und katalytisch stark von den klassischen Hämperoxidasen unterscheidet. Im Rahmen dieser Dissertation konnten durch ein systematisches Screening von Kristallisationsbedingungen Proteinkristalle von MscDyP1 mit einer hohen Auflösung generiert werden. Diese ermöglichten die Auflösung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms. Strukturelle Auffälligkeitenstellten zwei nicht-konservierte oberflächenexponierte Methionine (Met302 und Met305) dar, die eine wichtige strukturelle Rolle zu spielen schienen, die durch Mutagenesestudien bestätigt wurde. Außerdem besitzt MscDyP1 nur ein einzelnes und konserviertes Cystein (Cys360) das mit dem proximalen Koordinationspartner des Hämeisens verbunden ist und für kleine redox-aktive Moleküle zugänglich ist. Dies ließ die Möglichkeit der Redoxregulation von MscDyP1 über eine Modifikation des Cysteins zu. Gerichtete Mutagenese von Cys360 und heterologe Überexpression der Mutante in E. coli führten zu einer signifikant verringerten spezifische Aktivität und geringeren Affinität zu Wasserstoffperoxid. Darüber hinaus wies die Mutante eine geringere Anfälligkeit gegenüber der Suizidinhibierung durch hohe Wasserstoffperoxidkonzentrationen auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cys360 in vitro eine Rolle in der Redoxregulation von MscDyP1 spielt. Alkylierungsexperimente des rekombinanten Enzyms aus E. coli und Aspergillus niger zeigte allerdings, dass Glykosylierung von MscDyP1 Cys360 vor Oxidation schützt. Infolge der starken Glykosylierung des nativen Enzyms ist eine Redoxregulation in vivo daher unwahrscheinlich.
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