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Analyse des genom-weiten Bindeverhaltens des Faktors CTCFL

Analysis of the genome-wide binding pattern of the factor CTCFL

Bergmaier, Philipp Franz Hermann


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-122865
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12286/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Genetik
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 21.10.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Der wichtige, multifunktionale Faktor CTCF, der als zentrales Element bei der Ausbildung drei-dimensionaler DNA Kontakte und Chromatin-Organisation identifiziert wurde, und sein Testis-spezifischer paraloger Faktor CTCFL zeichnen sich durch eine fast identische ZF-Domäne, die die DNA Bindung vermittelt, aus. Die stark unterschiedlichen Carboxy- und Amino-terminalen Domänen lassen jedoch auf funktionelle Unterschiede der beiden Proteine schließen. Genom-weite Analysen konnten neben einer großen Zahl gemeinsamer, genomischer Bindestellen auch jeweils individuelle Bindestellen identifizieren. Da inzwischen die gemeinsame Präsenz beider Faktoren in Testis-Zellen aber auch in bestimmten Krebsformen bestätigt wurde, kommt der Erforschung der Auswirkungen von CTCF und CTCFL an gemeinsamen Bindestellen eine neue Bedeutung zu.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die möglichen Sequenz-spezifischen oder Chromatinbedingten Grundlagen der differentiellen Bindemuster von CTCF und CTCFL analysiert werden. Dazu wurde unter Verwendung der umfangreichen ENCODE Datenbank eine bioinformatische Korrelationsanalyse durchgeführt, die zeigen konnte, dass aktive Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktoren an CTCFL Bindestellen, im Vergleich zu CTCF Bindestellen, angereichert vorliegen. Komponenten des Cohesin-Komplexes konnten gleichzeitig als einzige CTCF-spezifische Cofaktoren identifiziert werden. In ChIPseq Experimenten gefolgt von konventionellen ChIPs konnte kein Einfluss von CTCFL Bindung auf CTCF, Histon-Modifikationen oder Cohesin-Komponenten festgestellt werden. Zur weiteren Untersuchung in Zellkultur wurden P19 Zellen mit induzierbarer CTCFL-Expression hergestellt. Vergleichenden Analysen mit einem bereits beschriebenen, weiteren Klon konnten mittels FAIRE Experimenten differentielle DNAZugänglichkeit als Basis von Zelltyp-spezifischen CTCFL-Bindemustern identifizieren. Weitere Versuche, anhand von Chromatin-Veränderung in Folge von Differenzierung, die CTCFL-Bindung innerhalb des P19 Klons zu modulieren waren nur an zwei untersuchten Bindestellen (Ptprg & Mzf1) erfolgreich.
Um mögliche weitere Einflüsse auf die CTCF- und CTCFL-Bindung zu untersuchen wurden Analysen der genauen DNA-Bindemotive durchgeführt. Im Zuge dieser Experimente konnten sehr ähnliche DNA-Sequenzen identifiziert werden, die in vivo stark abweichende Bindung der beiden Faktoren zeigen. Somit wurde neben dem Chromatin-Einfluss auf die CTCFL Bindung auch eine potenzielle Rolle der gebundenen DNA-Sequenz identifiziert, die es lohnt in weiteren Experimenten zu überprüfen.
Kurzfassung auf Englisch: The important multifunctional factor CTCF, known to be the central element of threedimensional DNA contacts and involved in chromatin organisation, and its testis-specific paralogue CTCFL are sharing a nearly identical zinc finger DNA-binding domain. Strong differences in N- and C-termini are probably associated with differential function of the two proteins. Genome-wide analysis revealed a strong overlap of binding sites for both factors but also individual sites. With newer knowledge that both factors actually are expressed in the same cells in testis and also some cancer types, research into the functional consequences of CTCF and CTCFL at shared binding sites becomes more important.
Within this work the possible sequence- and chromatin-driven discrimination in CTCF and CTCFL binding events was examined. Utilizing the extensive ENCODE database bioinformatic correlation analyses were performed and active histone-modifications and transcription factors were enriched at CTCFL binding sites compared to CTCF sites. Only Cohesin-complex components could be identified to be overrepresented at CTCF binding sites. No Influence of CTCFL binding could be identified on CTCF, histone modifications or Cohesin components when performing ChIPseq for CTCF & CTCFL followed by conventional ChIP experiments. For further experiments in cell culture, an inducible CTCFL expression system was also established in P19 cells. Comparative analysis between different cell clones could then show that differential openness of chromatin, as measured by FAIRE, explains cell-type-specific CTCFL binding patterns to a degree. Experiments with differentiating P19 cells could show that CTCFL binding at two selected regions (Ptprg & Mzf1) could be modulated by inducing chromatin changes.
To assess a possible influence of the DNA motif on CTCF & CTCFL binding, detailed analysis of the precise involved DNA sequences were performed. Two highly similar sequences could be identified showing drastically different CTCF and CTCFL binding occupancies in vivo. These results in addition to the role of open chromatin provide a hint at a possible role of the DNA sequence on CTCFL binding and it would be worthwhile to test this experimentally in the future
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