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Untersuchung der heterotopen Ossifikation bei akutem spinalem Trauma

Analysis of heterotopic ossification after spinal cord injury

Grajales Robles, Viviana


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-121681
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12168/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): heterotope Ossifikation , spinales Trauma , Rattenmodell
Freie Schlagwörter (Englisch): heterotopic ossification , spinal cord injury , rat model
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Pathologie; Department Orthopädie, Unfallchirurgie und Paraplegiologie, Universitätsklinikum Heidelberg
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.05.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 14.07.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Heterotope Ossifikation (HO) bezeichnet die Bildung von Knochen außerhalb des normalen Skeletts und ist bekannt als Komplikation nach spinalen Traumata. Der Pathomechanismus ist jedoch noch immer weitgehend ungeklärt und es fehlt an relevanten Tiermodellen.
Ziel dieser Arbeit war es, ein Tiermodell in der Ratte zu etablieren, an dem kausale Faktoren für das Auftreten von heterotopen Ossifikationen nach akutem spinalem Trauma (acute spinal cord injury (ASCI)) identifiziert werden können. Dafür wurde ein Modell des spinalen Traumas, relevant zur Situation des Menschen, mit einem heterotopen Implantationsmodell kombiniert. Zur Unterscheidung lokaler gegenüber systemischen Faktoren des spinalen Traumas sollte die heterotope Ossifikation gleichzeitig kranial und kaudal des Querschnittniveaus intramuskulär induziert und mit Kontrolltieren verglichen werden.
Die Literaturübersicht erläutert den Begriff der neurogen bedingten heterotopen Ossifikation (NHO) und stellt die Problematik in der Humanmedizin dar. Im Weiteren werden der Stand der Forschung in Bezug auf Ätiologie und Pathogenese der HO und die verfügbaren Tiermodelle umrissen. Danach folgen eine kurze Ausführung über das spinale Trauma und die Modelle der Forschung sowie ein Überblick über die biochemischen Marker und Wachstumsfaktoren, die in dieser Studie untersucht wurden.
Zur Entwicklung eines geeigneten HO-Modells für die Hauptstudie wurden zunächst unterschiedliche HO-Modelle, Implantationsorte, Trägermaterialien und BMP-2-Dosierungen an insgesamt 16 Tieren in Vorstudien getestet.
Die Hauptstudie wurde an 10 Sprague-Dawley-Ratten in einem Alter von drei Monaten durchgeführt. Als Implantat wurde ein Kollagenvlies mit 50 µg BMP-2 verwendet. Dieses wurde an der Vordergliedmaße in den M. triceps brachii und an der Hintergliedmaße in den M. semitendinosus operativ bei allen Versuchstieren beidseits eingebracht. Die akute Rückenmarkschädigung wurde in Form einer Rückenmarkkontusion mit dem IH Spinal Cord Impactor (IH-0400) an fünf Tieren durchgeführt. Die Kontrolltiere erhielten eine Sham-Operation in Form einer Laminektomie. Nach vier-wöchiger Implantation wurde der heterotop gebildete Knochen mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) analysiert (Hauptparameter: Knochenvolumen). Des Weiteren wurden die entnommenen Proben histologisch und immunhistologisch (CD68) untersucht. Zusätzlich wurden mittels ELISA die Plasmagehalte von Markern des Knochenstoffwechsels (bone-specific alkaline phosphatase (BALP), crosslaps) und ausgewählten Wachstumsfaktoren (vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-beta (TGF-ß2)) bestimmt.
Die Rückenmarkkontusion führte zu einer moderaten inkompletten Querschnittlähmung mit partieller funktioneller Wiederherstellung nach vier Wochen. Es wurde bei allen Tieren eine HO induziert und in quantitativen Mikro-CT-Analysen ein signifikant vergrößertes Knochenvolumen (3,9-fach) der HO an der Vordergliedmaße von Ratten mit einem spinalen Trauma im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt. An der Hintergliedmaße konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede im Knochenvolumen festgestellt werden. Die restlichen Parameter der Mikro-CT-Analyse und der Histologie unterschieden sich nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen, jedoch traten Unterschiede zwischen Vorder- und Hintergliedmaße auf, die auf unterschiedliche Reifegrade der HO hindeuten. Bei der Analyse von Plasmaproben wurden bei den Ratten mit spinalem Trauma erhöhte serologische Werte an Crosslaps und TGF-ß2 im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt. BALP-Werte unterschieden sich nicht signifikant, die VEGF-Werte waren jedoch in der Kontrollgruppe signifikant höher. Die Ergebnisse deuten auf einen fortgeschritteneren Reifezustand der Knochenneubildungen der paraplegischen Tiere hin.
Die Hypothese der verstärkten Knochenneubildung nach akutem spinalem Trauma konnte in dieser Studie teilweise bestätigt werden, jedoch zeigten sich Diskrepanzen verglichen mit der Situation beim Menschen. Weitere Studien sind notwendig, um zu klären, weshalb sich das Phänomen nur auf die vordere Extremität beschränkt und welche Faktoren für die gesteigerte Knochenbildung verantwortlich sind. Erhöhte Plasmawerte von TGF-ß vier Wochen nach dem spinalen Trauma könnten an dem Prozess der HO beteiligt sein.
Kurzfassung auf Englisch: Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the normal skeleton. It is a common complication following spinal cord injury. However, the pathomechanism is still widely unknown and there is a lack of relevant animal models.
The purpose of this study was to establish a rat animal model to identify the causative factors of heterotopic ossification after acute spinal cord injury (ASCI). Therefor we combined a spinal cord injury model relevant to the situation in humans with a heterotopic implantation model. To differentiate local and systemic factors as a consequence of spinal cord injury, we induced the heterotopic ossification in muscles above and below the spinal lesion and compared results with a control group.
The literature review elucidates the term neurogenic heterotopic ossification and the difficulties present in human medicine in dealing with this entity. Moreover, the state of research concerning the etiology and pathogenesis of HO is presented and the available animal models are outlined. Furthermore, spinal cord injury and the relevant research models are described, followed by an overview of the biochemical markers and growth factors examined in this study.
To find a suitable model for the main study, different HO models, implantation sites, carriers and BMP-2 doses were tested in 16 animals in a preliminary study. The main study was performed with 10 three months old sprague dawley rats. We used a collagenous carrier loaded with 50 µg BMP-2. It was implanted in the biceps brachii muscle and the semitendinosus muscle on both sides. The acute spinal cord injury was produced in five rats using a contusion model (device: IH Spinal Cord Impactor (IH-0400)). In control animals, laminectomy was performed as sham operation. After four weeks of implantation, the heterotopically formed bone was analyzed by microcomputed tomography (micro-CT) (mean parameter: bone volume). Furthermore, explanted specimens were analyzed by histology and by immunohistochemical techniques (CD68). In addition, plasma levels of biochemical markers of bone turnover (bone-specific alkaline phosphatase (BALP)), crosslaps) and relevant growth factors (vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-beta (TGF-ß2)) were assessed with ELISA technique.
The contusion model produced a moderate incomplete spinal cord injury with partial functional recovery after four weeks. HO was induced in all animals and quantitative micro-CT analysis showed that heterotopic bone formation at the forelimb was significantly higher (3.9-fold) in the ASCI group compared to the control group. However, significant differences in bone volume at the hindlimb were not observed. The rest of the examined parameters of micro-CT-analysis and histology did not significantly differ between both experimental groups, but there were differences between HO at fore- and hindlimb, that indicate a different level of bone maturity. In the ASCI group, significantly higher plasma levels of crosslaps and TGF-ß2 were measured compared to the control group. The plasma values of BALP did not differ significantly between the groups whereas the levels of VEGF were significantly higher in the control group. These results indicate an advanced stage of bone maturation in the ASCI group.
In this study, the hypothesis of enhanced bone formation after spinal cord injury was partially verified, but differences compared to human HO were shown. Further investigations are necessary to elucidate why the phenomenon is restricted to the forelimb and to identify the causative factors for enhanced bone formation. Elevated levels of TGF-ß four weeks after spinal cord injury could be involved in the process of HO.

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