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Regulation and role of the pro-apoptotic transcription factor C/EBP homologous protein (CHOP) in type II cells apoptosis and Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF)

Klymenko, Oleksiy


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-121423
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12142/

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Freie Schlagwörter (Englisch): idiopathic pulmonary fibrosis , endoplasmic reticulum stress , apoptosis , fibroblast proliferation
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Innere Medizin II, Clinical Research Unit “Lung Fibrosis”
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 29.06.2016
Kurzfassung auf Englisch: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive fibrotic pulmonary disease of unknown origin with an unavoidable fatal outcome. In principle, IPF is characterized by alveolar epithelial cell damage, increased deposition of extracellular matrix (ECM) in the lung interstitium, and enhanced fibroblast/myofibroblast proliferation and activation. These processes ultimately lead to distortion of normal lung architecture and loss of respiratory function. Recent data show that Endoplasmic reticulum (ER) stress and apoptosis of alveolar epithelial cells type II (AECII) play a key role in both, sporadic and familial forms of IPF. It has been shown that an overload and accumulation of unfolded and misfolded proteins lead to ER stress. C/EBP homologous protein (CHOP) is thought to represent a key regulator of pro-apoptotic responses under ER stress. In IPF, induction and nuclear translocation of CHOP in AECII is regularly found, to a weaker extent also in yet not fibrotic areas of these lungs. Following this line, we hypothesized that ER stress-induced CHOP may significantly contribute to AECII injury and apoptosis and hence fibrosis development in IPF. The present study therefore aimed to (i) characterize the transcriptional regulation of epithelial CHOP expression in vitro, and (ii) to elucidate the biological role of Chop in the induction of epithelial apoptosis and lung fibrosis in vitro and in vivo.
For such purpose, the promotor of the human CHOP gene was extensively analyzed employing a luciferase reporter gene assay. We identified a new mechanism for the regulation of CHOP expression during ER stress. According to our data, Ap-1 and c-Ets-1 transcription factors are up-regulated in the lung epithelium under ER-stress conditions, interact with each other and jointly bind to the Chop promotor, thereby inducing the Chop gene expression.
Moreover, the role of Chop in the induction of epithelial apoptosis was studied using various in vitro and in vivo models. Exclusive Chop overexpression was achieved in vitro using an inducible "Tetracyclin-On" ("Tet-on")-system in stably transfected epithelial MLE 12 cells and in isolated, primary alveolar type II cells. Both in vitro models revealed induction of cleaved caspase 3 and thus apoptosis in response to Chop overexpression. In addition, incubation of murine lung fibroblasts with supernatants of these stably transfected cells resulted in increased fibroblast proliferation once Chop was induced by doxycyclin application. Moreover, in vivo data support the results of in vitro studies. Conditional Chop overexpression in AECII in vivo was achieved by crossing SP-C rtTA to tetO7 Chop mice. In response to oral doxycyclin feeding, Chop was induced in AECII and led to Caspase 3 cleavage and thus apoptosis of these cells. Furthermore, induction and up-regulation of Chop target genes such as Casp11, Il1b, Il6, Ero1a, Dr5, and Gadd34 was detected on mRNA level by qPCR. In short term periods covering 8 weeks, young transgenic mice with inducible, AECII-specific Chop overexpression did yet not show a distinct fibrotic phenotype, although we could detect significant up-regulation of pro-fibrotic markers. Thus, involvement of Chop in the development of lung fibrosis requires further investigation.
Our findings demonstrate for the first time that AP-1 and c-Ets-1 play an important role in the transcriptional regulation of CHOP expression during ER stress. Additionally, we provide evidence that Chop expression alone is sufficient to induce apoptosis in AECII and consecutive fibroproliferation, hence suggesting a pivotal role of CHOP in the pathogenesis of pulmonary fibrosis.
Kurzfassung auf Deutsch: Die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine schwerwiegende, progressive Lungenerkrankung unbekannter Genese, die auch heute noch eine unbefriedigende Überlebenszeit aufweist. Die IPF ist durch eine chronische Schädigung und exzessive Apoptose von alveolären Typ II Zellen (AECII), durch exzessive Ablagerung von extrazellulärer Matrix im Lungeninterstitium, und durch eine gesteigerte Aktivierung und Proliferation von Fibroblasten und Myofibroblasten charakterisiert. Diese Prozesse führen durch den progressiven Ersatz der normalen Lungenstruktur durch fibrotisches Bindegewebe zu einer Zerstörung der zarten Alveolar-Struktur, und hierdurch zu der klinisch im Vordergrund stehenden Verschlechterung des Gasaustausches und der Lungendehnbarkeit (Compliance).
Neueren Untersuchungen zufolge stellt ein Endoplasmatischer Retikulum (ER)-Stress mit konsekutiver Apoptose eine Hauptursache für die Schädigung und die Apoptose der AECII bei familiären und sporadischen Formen der IPF dar. In der Vergangenheit konnte bereits gezeigt werden, dass Proteinüberladung und Anhäufung von ungefalteten und missgefalteten Proteinen im ER zu schwerem ER-Stress führt. C/EBP homologous protein (CHOP) könnte hierbei eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von ER-Stress-induzierten Apoptose-Signalwegen spielen, und somit zu ER-Stress vermittelten Erkrankungen führen.
In IPF-Lungen ist die vermehrte Expression und nukleäre Translokation von CHOP in AECII eindeutig nachweisbar, in vermindertem Umfang auch in noch nicht fibrotisch umgebauten Arealen dieser Lungen. Wir verfolgten daher die Hypothese, dass die ER-Stress-induzierte AECII-Apoptose in IPF Lungen hauptsächlich durch CHOP vermittelt wird. Die Ziele in dieser Doktorarbeit waren daher i) die vollständige Aufklärung der transkriptionalen Regulation der epithelialen CHOP Expression in vitro, und ii) die Aufdeckung der biologischen Rolle der CHOP-Überexpression bei der Induktion von alveolär-epithelialer Apoptose und Lungenfibrose in vitro und in vivo.
In dieser Arbeit wurde der Promotor des humanen CHOP-Gens extensiv durch Luziferase-Reportergen-Assays analysiert, und dabei konnte ein neuer, bisher noch nicht beschriebener Mechanismus für die Regulation der CHOP-Expression unter ER-Stress Bedingungen identifiziert werden. So konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsfaktoren Ap-1 und c-Ets-1 im Lungenepithel unter ER-Stress-Konditionen hochreguliert werden, dabei in Interaktion miteinander an den murinen CHOP-Promotor binden, und auf diese Weise die Chop-Expression induzieren.
Die Beteiligung von Chop in der Induktion der alveolär-epithelialen Apoptose wurde anhand vielfältiger in vitro- und in vivo-Modelle untersucht. So wurde die Überexpression von Chop in vitro sowohl mit einem induzierbarem "Tetracyclin-On" ("Tet-On")-Expressionssystem in stabil transfizierten alveolär-epithelialen MLE12-Zellen als auch in isolierten, primären transformierten AECII direkt untersucht. Beide in vitro-Systeme zeigten Kaspase-3-Aktivierung und -Spaltung nach Überexpression von Chop. Zudem wurde eine Chop-abhängige, gesteigerte Proliferation von murinen Lungenfibroblasten beobachtet, nachdem diese mit Kulturüberstanden der epithelialen in vitro Modelle inkubiert wurden. Weiterhin wurden diese in vitro-Resultate durch die Ergebnisse von in vivo-Experimenten unterstützt. So resultierte die konditionale Chop-Überexpression in AECII in einem transgenen Maus-Modell (SP-C rtTA / tetO7 Chop) in vivo ebenfalls in einer Induktion von Kaspase-3-Spaltung und somit der Apoptose dieser Zellen. Zusätzlich wurde eine Induktion und Hochregulation der Chop-Targetgene Casp11, Il1b, Il6, Ero1a, Dr5 und Gadd34 auf Transkriptebene durch qPCR beobachtet. Im Kurzzeitexperiment von 8 Wochen zeigten diese transgenen jungen Mäuse mit konditionaler, AECII-spezifischer Überexpression von Chop (noch) keine Entwicklung von Lungenfibrose, obwohl profibrotische Gene in den Maus-Lungen signifikant hochreguliert waren. Daher sind zusätzliche Untersuchungen nötig, um die Involvierung von Chop bei der Entwicklung von Lungenfibrose zu klären.
Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass AP-1 und c-Ets-1 eine bedeutende Rolle in der transkriptionalen Regulation der CHOP-Expression während ER-Stress spielen. Zusätzlich konnte bewiesen werden, dass die alleinige Expression von Chop ausreicht um AECII in die Apoptose zu treiben und nachgeschaltet eine Fibroseantwort in vitro zu provozieren. Diese Ergebnisse zeigen daher eindeutig, dass CHOP eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der Lungenfibrose spielt.
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