Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

A-kinase anchoring proteins AKAP1, -4, -10 and -11 with different subcellular localizations in Sertoli cells and their roles in male fertility

Wang, Wenwen


Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (10.340 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-120755
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12075/

Bookmark bei del.icio.us


Freie Schlagwörter (Deutsch): AKAP , PKA , Sertoli-Zelle , Peroxisomen , PTS1 , Mitochondrien
Freie Schlagwörter (Englisch): AKAP , PKA , Sertoli cell , peroxisome , PTS1 , mitochondria
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie
Fachgebiet: Universität
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 19.05.2016
Kurzfassung auf Englisch: Sertoli cells in the testis regulate spermatogenesis and are involved in the molecular pathogenesis of male infertility, an increasing problem worldwide. They are controlled by testosterone and FSH signaling, which increases the intracellular cAMP-levels, leading to the activation of protein kinase A (PKA) and downstream phosphorylation events. Compartmentalization of PKA-dependent phosphorylation is controlled by a variety of distinct A-kinase anchoring proteins (AKAPs), tethering PKA by high affinity binding to a particular subcellular location. In this respect, it is of interest that rat AKAP220, partially homologous to the AKAP11 family, was described in peroxisomes of rat Sertoli cells, essential organelles for maintenance of normal lipid homeostasis and spermatogenesis regulation in this cell type.
Therefore, the aims of this thesis were to analyze the effects of FSH treatment on peroxisomal gene expression, to characterize the effect of PKA-AKAP220 signaling on peroxisomes and to eventually discover new AKAP family members localized in this cell organelle or in mitochondria in Sertoli cells. Mouse TM4 Sertoli cells were used as cell culture model system to study the effects of FSH signaling on the peroxisomal and mitochondrial compartment. Since it is well established in the literature that the mitochondrial steroidogenic acute regulatory protein (StAR) is stimulated by LH-receptor/PKA-AKAP-signaling in testicular Leydig cells, the Star mRNA expression was assessed in TM4 Sertoli cells. Indeed, the Star gene was expressed in TM4 Sertoli cells and its expression level was also FSH-regulated. With optimized cell culture and FSH-treatment conditions, the gene expression for a variety of peroxisomal biogenesis and metabolic proteins was analyzed. FSH-treatment induced the expression of Pex11alpha, Pex13, Cat, Acox2, and Abcd2 mRNAs, encoding proteins involved in proliferation, matrix protein import, ROS and lipid metabolism in peroxisomes, demonstrating that the organelle is influenced by FSH signaling. To verify the peroxisomal localization of AKAP220 (=AKAP11) and to study its effects on FSH-PKA-mediated spermatogenesis regulation, this protein was localized with a commercial antibody in different subcellular fractions and highly purified peroxisomes of TM4 cells. However, our follow-up experiments with Western blots, bioinformatic evolutionary tree analysis for conserved PTS1 signals in AKAPs, and sequence alignments between Akap11 cDNA and genome sequences revealed that the reported cloned rat Akap220 cDNA as well as the subsequent results of AKAP220 subcellular localization were artifacts.
Furthermore, during the series of experiments on rat Akap11 mRNAs in our laboratory, total RNA from a variety of rat tissues was isolated and the tissue-specific Akap11 gene expression was analyzed with specific sets of primer pairs, which revealed the highest Akap11 mRNA levels in the testis, pituitary, total brain and spleen and intermediate levels in liver, lung, heart and skeletal muscle. The same primers were used for subcloning parts of Akap11 in plasmid vectors for in vitro transcription of DIG-labelled cRNA-probes for Akap11 as well as corresponding mRNA controls. A non-radioactive Northern blot method was established, which can be used for future experiments on alternative splicing of Akap mRNAs.
Kurzfassung auf Deutsch: Sertoli-Zellen im Hoden regulieren die Spermatogenese und wirken an der molekularen Pathogenese männlicher Infertilität mit, einem zunehmenden medizinischen Problem weltweit. Sie werden durch Testosteron und den FSH-Signalweg kontrolliert, der den Anstieg von intrazellulärem cAMP induziert, zur Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) führt und nachfolgende Phosphorylierungsreaktionen auslöst. Die subzelluläre Lokalisierung PKA-abhängiger Phosphorylierungsprozesse wird durch verschiedene „A-kinase anchoring“-Proteine durchgeführt, die PKA durch hochaffine Bindung in spezifischen zellulären Kompartimenten verankern. Hierbei ist von Interesse, dass AKAP220 (=AKAP11) in Sertoli-Zellen der Ratte in Peroxisomen beschrieben wurde, essentiellen Zellorganellen in diesem Zelltyp zur Aufrechterhaltung der Homöostase des Lipidstoffwechsels und der Regulierung der Spermatogenese.
Deshalb waren die Ziele dieser Dissertation, die Auswirkung von FSH auf die peroxisomale Genexpression sowie die Auswirkungen der PKA-AKAP220-Signalkaskade auf Peroxisomen aufzudecken und eventuell neue AKAP-Familienmitglieder in dieser Zellorganelle oder in Mitochondrien zu charakterisieren. Maus TM4 Sertoli-Zellen wurden als Zellkulturmodell zum Studium der FSH-Effekte auf das peroxisomale und mitochondriale Kompartiment etabliert. Weil aus der Literatur bekannt ist, dass das „steroidogene akut regulatorische Protein“ (StAR) durch den LH-receptor/PKA-AKAP-Signalweg in testikulären Leydig-Zellen stimuliert wird, wurde die Star mRNA-Expression in TM4-Sertoli-Zellen untersucht. Tatsächlich, war die Star-Gen-Expression in TM4 Sertoli-Zellen vorhanden und auch die FSH-vermittelte Regulierung des Star-mRNA-Spiegels konnte nachgewiesen werden. Nach Optimierung der Zellkulturbedingungen und der FSH-Konzentrationen, wurde die Expression einer großen Anzahl von Genen für Biogenese- und metabolische Proteine der Peroxisomen analysiert. FSH-Behandlung führte zur erhöhten Expression von Pex11alpha-, Pex13-, Cat-, Acox2- und Abcd2-mRNAs, die Proteine für Proliferation, Matrixproteinimport, ROS-und Lipid-Stoffwechsel in Peroxisomen kodieren, was die Beeinflussung dieser Zellorganelle durch den FSH-Signalweg demonstriert. Um die peroxisomale Lokalisation von AKAP220 nachzuweisen und dessen Effekt auf die FSH-/PKA-vermittelte Spermatogeneseregulierung auszutesten, wurde versucht, dieses Protein mittels eines gekauften Antikörpers in unterschiedlichen subzellulären Fraktionen und hochgereinigten Peroxisomenfraktionen nachzuweisen. Jedoch erbrachten alle Folgeexperimente mit Western blots, bioinformatischer Evolutionsanalyse von AKAP-Proteinen mit konservierten PTS1-Sigalen sowie Sequenzvergleiche zwischen Akap11-cDNA und Genomsequenzen, dass die beschriebene, klonierte Ratte Akap220-cDNA sowie auch alle nachfolgenden Resultate über die subzelluläre Lokalisation des AKAP220-Proteins, Artefakte in der publizierten Literatur darstellten.
Innerhalb der Serie von Experimenten zur Akap11-mRNA-Expression in unserem Labor, wurden eine große Anzahl von Gesamt-RNA-Proben aus verschiedenen Rattenorganen isoliert und die gewebsspezifische Expressionsanalyse der Akap11-mRNA unter Verwendung spezifischer Primerpaare analysiert, welche die höchsten Akap11-mRNA-Spiegel in Gesamt-RNA aus Hoden, Hypophyse, Gehirn (gesamt) und Milz erbrachte, gefolgt von mittelhohen Mengen in Leber, Lunge, Herz und Skelettmuskel. Mithilfe der gleichen Primerpaare wurde die Subklonierung von verschiedenen Akap11-Anteilen in Plasmidvektoren zur Herstellung von DIG-markierten cRNA-Proben für Akap11 durchgeführt, entsprechende Vektoren für interne Kontrollen kloniert und eine nichtradioaktive Northern Blot-Methode etabliert, mit deren Hilfe in zukünftigen Experimenten alternative Spleißformen von Akap-mRNAs nachgewiesen werden können.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand