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All–trans retinoic acid recruits Smad3 to drive TGF–beta signaling in lung fibroblasts : new insights for the management of bronchopulmonary dysplasia with retinoids

Usemann, Jakob


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-120043
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12004/

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Freie Schlagwörter (Englisch): all-frans retinoic acid , bronchopulmonary dysplasia , prematurity , TGF–beta signaling , vitamin A
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik II und Poliklinik
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.01.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 08.04.2016
Kurzfassung auf Englisch: There is currently much interest in using retinoids such as all–trans retinoic acid (ATRA), or retinoid analogs such as vitamin A (retinol), in the management of premature neonates at risk for the development of bronchopulmonary dysplasia (BPD). Current clinical evidence is contradictory, with some reports suggesting benefits, while other reports suggest no impact, or a deleterious effect of retinoid administration. In contrast, retinoids generally perform very well in animal models of BPD, and serve to stimulate lung development, particularly alveolarization. In this study, we attempted to evaluate the impact of retinoids on the activity of the transforming growth factor (TGF)–beta signaling pathway, a pathway that has been credited with high importance in driving lung development and alveolarization.
We employed NIH/3T3 mouse fibroblasts to study the impact of ATRA on TGF–beta signaling. While the NIH/3T3 cell line differs in some important aspects to that of lung fibroblasts, it is reasonable to assume that NIH/3T3 have a similar biological behavior to that of airway fibroblasts in tissue. We observed that ATRA had a dramatic effect on TGF–beta signaling in NIH/3T3 cells. Pre-treatment of NIH/3T3 cells with ATRA caused a strong increase in TGF–beta signaling, as assessed by phosphorylation of Smad3, and by a luciferase-based promoter-reporter assay. Further studies revealed that this effect was caused by the ability of ATRA to strongly increase Smad3 expression levels in NIH/3T3 cells. Using plasmid-mediated overexpression of the smad3 gene, we confirmed these observations, and showed that increased Smad3 levels in NIH/3T3 cells can indeed make the NIH/3T3 cells more responsive to TGF–beta. To further support these data, we also down-regulated smad3 gene expression using siRNA directed against Smad3, and demonstrated that by down-regulating smad3 expression, the pro-TGF–beta signaling effect of ATRA was lost. We also demonstrated that the degree of change in smad3 gene expression caused by ATRA stimulation is sufficient to cause a significant change in the TGF–beta signaling pathway.
Together, these data demonstrate that ATRA administration can upregulate TGF–beta signaling in NIH/3T3 cells. This may have important consequences for lung development, since TGF–beta drives multiple fibroblast functions such as extracellular matrix (ECM) production, as well as ECM reshaping in developing organs. Future studies should address the cross-talk of TGF–beta and retinoid signaling on other lung cell types, primary cells, and in animal models of BPD, in order to complete the picture of how retinoids may influence lung organogenesis. With a better understanding about the impact of retinoids on lung fibroblasts function and lung development one might be able to optimize the administration of retinoids in patients with BPD and thus improve clinical outcome.

Kurzfassung auf Deutsch: Aktuell besteht ein großes Forschungsinteresse in der Verwendung von Retinoiden wie Vitamin A Säure (englisch: all–trans retinoic acid (ATRA)) oder Retinoid-Analoga wie Vitamin A (Retinol) bei der Behandlung von Frühgeborenen, welche an Bronchopulmonaler Dysplasie (BPD) erkrankt sind. Der klinische Effekt von Vitamin A bei der Behandlung von BPD ist sehr widersprüchlich. Manche Studien berichten Erfolge, wobei andere Studien keinen Effekt oder sogar schädliche Auswirkungen bei der Verwendung von Vitamin A berichten. Hierzu steht im Widerspruch, dass Retinoide meist eine sehr gute Wirksamkeit in BPD Tiermodellen zeigen, wo sie die Lungenentwicklung, insbesondere die Alveolarisierung fördern. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkung von Retinoiden auf die transformierende Wachstumsfaktor–beta (englisch: transforming growth factor (TGF)–beta) Signalkaskade. Der TGF–beta Signalkaskade wird eine wichtige Bedeutung für die Lungenentwicklung und Alveolarisierung zugeschrieben.
Zur Untersuchung des Einflusses von ATRA auf die TGF–beta Signalkaskade verwendeten wir NIH/3T3 Maus-Fibroblasten. Diese unterscheiden sich in einigen wichtigen Aspekten von Lungenfibroblasten, jedoch wird angenommen, dass NIH/3T3 Zellen ähnliche biologische Funktionen wie Lungenfibroblasten erfüllen. Wir konnten zeigen, dass ATRA einen dramatischen Effekt auf die TGF–beta Signalkaskade in NIH/3T3 Zellen hat. Die Vorbehandlung von NIH/3T3 Zellen mit ATRA resultierte in einer starken Zunahme der TGF–beta Signaltransduktion, was durch die Bestimmung der Phosphorilisierung von Smad3 und in einem Luciferase Promoter-Assay untersucht wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt durch ATRA hervorgerufen wurde, welches die Fähigkeit besitzt, die Smad3 Expression in NIH/3T3 Zellen zu erhöhen. Wir konnten mit Hilfe einer Plasmid-vermittelten Überexpression des smad3 Gens diese Beobachtung bestätigen und konnten zeigen, dass durch eine Erhöhung von Smad3 in NIH/3T3 Zellen diese Zellen gegenüber TGF–beta sensibilisiert werden. Um diese Beobachtung zu bestätigen, unterdrückten wir die Smad3 Gen Expression unter der Verwendung von siRNA gegen smad3 und zeigten durch die Reduktion der smad3 Expression einen Verlust der ATRA-abhängigen TGF–beta Stimulation. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Ausmaß der smad3 Gen Expression durch ATRA intensiv genug ist, um signifikante Veränderungen in der TGF–beta Signalkaskade zur Folge zu haben.
Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass die Administration von ATRA die Aktivität der TGF–beta Signalkaskade in NIH/3T3 Zellen erhöhen kann. Diese Beobachtung könnte wichtige Auswirkungen auf die Lungenentwicklung haben, da TGF–beta verschiedene Funktionen von Fibroblasten reguliert. Hierzu zählt die Produktion von extrazellurärer Matrix (ECM), aber auch der Umbau der ECM bei sich entwickelnden Organen. Ergebnisse dieser Studie bilden eine Basis für zukünftige Studien, welche die Interaktion von TGF–beta und Retinoiden in anderen Zelltypen wie z.B. primären Zellen, aber auch in BPD Tiermodellen untersuchen sollten, um den Einfluss von Retinoiden bei der Organentwicklung weiter zu verstehen. Mit einem besseren Verständnis über die Bedeutung von Retinoiden auf die Funktion von Fibroblasten und auf die Lungenentwicklung besteht das Potential, den therapeutischen Einsatz von Retinoiden bei BPD zu optimieren und den Verlauf der Erkrankung positiv zu beinflussen.
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