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Etablierung eines Testsystems zum Studium der Mutationsreparatur von XLRP in vitro

Establishment of an in vitro test system for further studies of repair mechanisms for disease causing mutations in XLRP

Moennig, Eva


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-119852
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/11985/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Mutationsreparatur , XLRP
Freie Schlagwörter (Englisch): repair mechanisms , disease causing mutations in XLRP
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Labor für molekulare Ophthalmologie, Abteilung Augenheilkunde
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.02.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 10.03.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die x-chromosomale Form der Retinitis pigmentosa wird in 80 % der Fälle durch eine Mutation in der ORF15- Region des RPGR (Retinitis pigmentosa GTPase regulator)-Gens verursacht. Eine kausale Behandlung für die XLRP gibt es bisher nicht, eine Re-paratur der krankheitsauslösenden Mutation stellt jedoch eine Therapiemöglichkeit dar. Ein Mausmodell, welches Punktmutationen im ORF15-Exon sowie eine I-Sce-I-Schnittstelle in unmittelbarer Nähe aufweist (B6J.Sv129-Rpgrtm1Sti), steht für die Thera-pieentwicklung zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines in-vitro-Modellsystems basierend auf dem Mausmodell zum Studium von homologer Reparatur als Therapiemethode für die XLRP.
Lymphozyten und Knochenmarkzellen wurden aus 4, 6, 8 und 12 Wochen alten Mäusen isoliert, kultiviert und neben der spontanen Immortalisierung diese durch folgende Ver-suche zur Immortalisierung provoziert: Bestrahlung mit UV-Strahlen in den Intensitäten von 4-100 J/m², Versetzen der Zellen mit 5 µM aromatischen Kohlenwasserstoffs Ben-zo[a]pyren über 48 Stunden, und Transfektion der Zellen mit dem onkogenen Large-T-Antigen des Simian Virus 40. Parallel wurde die mutierte RPGRORF15-Sequenz in den pcDNA5-frt-Vektor kloniert. Anschließend erfolgte eine Co-Transfektion mit dem Re-combinase-Expressions-Vektor pOG44 zur Integration in das Genom von HEK293-Flp-In-Zellen. PCR und Sequenzierung wurden zum Nachweis einer erfolgten Integration genutzt. Die HEK-Flp-In-RPGRORF15-Zellen wurden mit einem I-Sce-I-Expressionsplasmid transfiziert und die Aktivität der I-Sce-I-Endonuklease mit dem T7 Assay geprüft.
Es gelang nicht, eine primäre Zelllinie aus dem XLRP-Mausmodell zu generieren. Die Provokation der Immortalisierung durch die verschiedenen Methoden führte jeweils zur Apoptose der Zellen. Die HEK-Flp-In-RPGRORF15-Zelllinie konnte erfolgreich herge-stellt werden. Im T7 Assay konnte gezeigt werden, dass die Zellen die I-SceI-Endonuklease exprimieren und diese einen Doppelstrangbruch induzieren kann, welcher durch endogene Mechanismen repariert wird.
Die HEK-Flp-In-RPGRORF15-Zelllinie kann zum Studium der Effizienz und Spezifität verschiedener Nukleasen genutzt werden und als initiales Modell für Homologie-vermittelte Reparatur in HEK-Zellen gelten. Somit konnte erfolgreich ein in-vitro-Testsystem zum Studium der Mutationsreparatur von XLRP etabliert werden.
Kurzfassung auf Englisch: In 80% of all cases the x-chromosomal form of retinis pigmentosa is caused by a muta-tion within the ORF 15 region of the RPGR (Retinitis pigmentosa GTPase regulator) gene. Currently there is no known causal therapy for XLRP existent. However gene replacement therapy could prove to be a feasible therapeutic option. The B6J.Sv129-Rpgrtm1Sti mouse model was created through three point mutations within the ORF 15 exon and the insertion of a neighbouring I-Scel-restriction site. It is available for design and development of therapeutic options. The aim of this thesis was to establish a cell culture system based on the mouse model for further studies of homologous repair as a therapeutic option for XLRP.
Lymphocytes and bone marrow cells were isolated and cultivated from 4, 6, 8 and 12 weeks old mice. Attempts to provoke immortalization included exposure to UV radia-tion with an intensity of 4-100 J/m2, exposure to 5µM polycyclic aromatic hydrocarbon (Benzoapyrene) over 48 hours and transfection of the cells with the oncogenic large T Antigen of the Simian virus 40. In addition, the mutated RPGR ORF 15 sequence was cloned into the pcDNA5-frt-Vector simultaneously. Subsequently the vector was co-transfected with the Recombinase-Expression-Vector pOG44 for integration into the genome of HEK293 Flp-in cells. The successful integration was verified by PCR and sequencing. The HEK Flp-In RPGRORF15 cells were transfected with I-Scel expression plasmid and the activity of the I-SceI endonuclease was tested using a T7 assay.
The attempts to generate an immortalized cell from the XLRP mouse model failed since the cells always died through apoptosis. However, the generation of the HEK Flp-In RPGRORF15 cell line was successful. The T7 assay demonstrated that the cells were able to express I-SceI endonuclease, which in turn resulted in specific double-strand breaks. Furthermore the DNA damage was repaired by endogenous mechanisms.
The HEK Flp-In RPGRORF15 cell line can be used for studies concerning efficiency and specificity of other nucleases and can be applied as an initial test system for homology-mediated repair in HEK cells. Thus, an in vitro test system has been established for fur-ther studies of repair mechanisms for disease causing mutations in XLRP.
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