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Bedeutung der morphometrischen Variationen und des Protamingehaltes von Spermatozoen in Korrelation zur Fruchtbarkeit bei Warmbluthengsten

Fernández Vergano, Augusto José


Originalveröffentlichung: (2015) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.656 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-118560
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/11856/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6391-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 26.01.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob mit Hilfe der computergestützten, morphometrischen Analyse von Spermien und der molekular biologischen Analyse der Kernkondensation die Fertilität eines Hengstes prädiktiv beurteilt werden kann. Für die Untersuchungen standen am Anfang der Saison 2009 insgesamt 55 Warmbluthengste im Alter zwischen 3 und 19 Jahren zur Verfügung. Es wurde eine spermatologische Standarduntersuchung der Ejakulate und eine morphometrische Untersuchung mit Hilfe des Computerprogramms ISAS durchgeführt. Darüber hinaus erfolgte die Bestimmung der Spermienchromatinintegrität nach dem „flow cytometric of acridine orange test“ (FCAOT) Verfahren. Durch die Verwendung von RT-qPCR spezifischen Primern, angepasst an die genomische Sequenz der Pferde, konnte die Expression in Hodengewebe und Ejakulat der 55 Hengste , Protamin-1 und zwei Varianten von Protamin-2 (Protamin-2 und Protamin-3), erfolgreich nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von spezifischen monoklonalen Antikörpern konnte die stadien-spezifische Expression des Protamins-1 während der physiologischen Spermatogenese nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von den generierten Antikörpern gegen humanes Protamin-2 konnte in den Gewebeschnitten der Hengste kein Protamin-2 nachgewiesen werden. Dies beweist jedoch nicht den Mangel an Protamin-2, sondern die niedrige Affinität der Antikörper und ihrer Erkennung der Epitope für das Protamin-2 der Hengste. Basierend auf den Fertilitäsparametern NRR 28% (non-return-rate in Prozent) Werten wurden die Hengste in drei Quartile unterteilt: Das erste Quartil (n=14) entspricht der Hengstgruppe mit niedriger, das zweite und dritte Quartil (n=27) der mit mittlerer und das vierte Quartil (n=14) der mit hoher Befruchtungsleistung. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede der Furchtbarkeit in Bezug auf das Lebensalter der Hengste festgestellt werden (Durchschnitt 8,05±4,8 Jahre). Bei der statistischen Auswertung ergaben sich folgende Ergebnisse: Hengste mit hoher durchschnittlicher Befruchtungsleistung (Quartil 3) (272,07±64,5 Millionen von Spermien pro Milliliter MioS/ml) wiesen eine niedrigere Spermienkonzentration auf, verglichen mit den Hengsten mit niedriger Befruchtungsleistung (Quartil1) (336,14±123,2 MioS/ml) (p-Wert= 0,076). Die Spermienkonzentration zeigte auch einen Unterschied zwischen den Hengsten der Quartile 1 und 2 (p=0,022). Im Hinblick auf die Untersuchung der anderen spermatologischen Standardparameter wurde in der vorliegenden Studie bei den untersuchten Hengsten eine positive Korrelation zwischen der Fertilität und der Morphologie dargestellt. Die Fruchtbarkeit stand mit den anderen untersuchten Spermienparametern, Volumen und progressiver Motilität, in keinem Zusammenhang. Die morphometrische Untersuchung der Spermien zeigte Unterschiede in der Länge der Spermienköpfe zwischen den Gruppen (1 vs. 2: p=0,036), (1 vs. 3: p=0,049). Es wurde keine Signifikanz zwischen den Gruppen 2 und 3 festgestellt (p=0,071). Auch zeigte sich kein Unterschied im Perimeter, in der Breite und Area der Spermienköpfe in den verschiedenen Gruppen. Bei der Untersuchung der DNS-Integrität wurde ein Durchschnitt von ca. 5% DFI in der gesamten Hengstpopulation festgestellt. Ein relevanter statistischer Unterschied zwischen den drei Fertilitätsgruppen konnte bei der Auswertung nicht festgestellt werden. In der gesamten Population der 55 Hengste variierte die relative Expression von Protamin-1 zwischen 10,1-8,6 und Protamin-2 zwischen -2-5,6. Die Analyse der Ratio beider Protamine ergab einen Bereich zwischen -6,4-11,2. In Gruppe 1 (Hengste mit niedriger Fertilität) lag der Durchschnitt der P1/P2-Ratio bei 1,5±4,5. Die statistische Auswertung ergab einen signifikanten Unterschied im P2/P1- Verhältnis zwischen den Gruppen 1 und 3 (p=0,014). Auffallend ist, dass der signifikante Unterschied nur für die Expression der Protamine-1 (p=0,019) nachgewiesen werden konnte, nicht jedoch für die Protamine-2 (p=0,049) im Vergleich der Gruppen 1 und 3. Die Untersuchungen zeigten eine deutliche Korrelation zwischen Fertilität (NRR 28%) und der relativen Expression von Protamin-1 (correlation co-efficiency p=0,019), sowie eine positive Korrelation zwischen Fertilität und P1/P2-Ratio (correlation co-efficiency p=0,017). Die vorliegende Studie zeigt, dass die Protamin-1-mRNA-Expression ein wertvoller Parameter zur Beurteilung der Chromatin-Kondensation des Spermatozoenkerns beim Hengst darstellt. Das P2/P1-mRNA-Verhältnis korreliert positiv mit der NRR 28. Die besten Fertilitätsraten von 90 bis 100% (NRR 28%) wurden bei Hengsten erzielt, deren Spermien ein P2/P1-mRNA-Verhältnis zwischen 6 bis 10 aufwiesen. Die Studie verdeutlicht, dass das P2/P1-mRNA-Verhältnis als sinnvoller prädiktiver Fruchtbarkeitsparameter beim Hengst verwendet werden kann.
Kurzfassung auf Englisch: The objective of the present study was with the help of computer supported morphometrical analysis of semen, and the biomolecular analysis of nuclear condensation, to investigate whether the fertility of a stallion can be accurately predicted. The investigation was conducted at the beginning of the 2009 breeding season, and incorporated 55 warmblood stallions between 3 and 19 years of age. A standard spermatological examination of each ejaculate was conducted along with a morphometric assessment with the help of the ISAS computer program and the determination of spermatozoal chromatin integrity using the flow cytometric of acridine orange test´ (FCAOT). With the use of RT-qPCR primers adapted to the equine genome sequence, the presence of Protamine-1 and two variations of Protamine-2 (Protamine-2 and Protamine-3) in the testicular tissue and ejaculate of the 55 stallions could be successfully proven. The utilisation of specific monoclonal antibodies allows the detection of the status specific expression of Protamne-1 during normal spermatogenesis. Through the use of generated antibodies against human Protamine-2, there was no evidence of Protamine-2 in the tissue samples taken from the stallions. This does not prove a lack of Protamin-2 but rather a reduced affinity between the antibodies and their recognition of the epitopes for the stallion Protamine2. According to the mare fertility descriptor (the “none-return-rate 28 percentage” or NRR 28%) the stallions were divided across three quartiles: the first quartile (n=14) includes the stallions with low, the second and third quartiles (n=27) with middle and the fourth quartile (n=14) with high fertility. There was no statistical significance between the fertility and the age of the stallions (average 8,05±4,8 years old) By statistical analysis the following results were produced: Stallions with a high average fertility rate (Quartile 3) (272,07±64,5 million sperm per milliliter MioS/ml) reported a reduced sperm concentration when compared to the stallions with low fertility rates (Quartile 1) (336,14±123,2 MioS/ml) (p= 0,076). The sperm concentration also showed a difference between the stallions in Quartile 1 and 2 (p=0,022). Die morphometric examination of the sperm showed differences in the length of the spermatozoal head, between the Quartiles (1 vs. 2: p=0,036), (1 vs. 3: p=0,049). There was however, no difference in perimeter, width and area of the spermatozoal head between the groups. The fertility rate did not correlated with any of the other semen parameters examined. Examination of the DNS integrity demonstrated an average of approximately 5% DFI across the entire sample population. A statistically relevant difference between the three quartile was not discovered after analysis. The results demonstrate that expression of protamine, in germinal cells throughout their development, is also in stallions highly conserved. In the entire population of 55 stallions, the expression of Protamine-1 varied between 10,1-8,6 and Protamine-2 between -2-5,6. The analysis of both Protamins gave a range between -6,4-11,2. In group 1 (stallions with reduced fertility) the average of the P1/P2 ratio was 1,5±4,5. The statistical analysis produced a significant difference in the P1/P2 relationship between groups 1 and 3 (p=0,014). What became apparent was the demonstration of a significant difference for expression of Protamine-1 (p=0,019), and not that of Protamine-2 (p=0,049) when comparing groups 1 and 3. The analysis showed a high correlation between the fertility (NNR 28%) and the relative expression of Protamine-1 (correlation co-efficiency p=0,019), as well as a positive correlation between fertility and the P1/P2 ratio (correlation co-efficiency p=0,017). The presented study shows that expression of the Protamine1-mRNA is a useful factor in determining the chromatin-condensation within the spermatozoal nuclei of the stallion. The relationship between P2/P1 mRNA and NRR 28% shows a positive correlation. Stallions with a P2/P1 mRNA ratio between 6 and 10 demonstrated optimal fertilisation rates of between 90-100% (NRR 28%). The study confirmed that the P2/P1 mRNA ratio is a useful factor in the prediction of stallion fertility.
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