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Experimentelle Untersuchungen zur Funktion von Aquaporin 1 in der Pathogenese der Osteoarthrose

Kramm, Ina


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-118030
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11803/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Osteoarthrose , Aquaporin 1 , Arthrose
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Lehrstuhl für Innere Medizin mit Schwerpunkt Rheumatologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 02.12.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die Osteoarthrose ist die Gelenkerkrankung mit der weltweit höchsten Prävalenz. Das Krankheitsbild weist eine multifaktorielle Genese auf und tritt in verstärktem Maße mit zunehmendem Lebensalter auf. Die therapeutischen Maßnahmen beschränken sich überwiegend auf den Einsatz antiphlogistisch und analgetisch wirksamer Medikamente sowie chirurgischer Interventionsmöglichkeiten bis hin zum endoprothetischen Gelenkersatz. Aufgrund der demographischen Entwicklung bedarf es weiterer, den Erkrankungsverlauf positiv modulierender Therapieansätze, um die zunehmenden sozioökonomischen Herausforderungen zu bewältigen. Dies setzt ein verbessertes Verständnis der Pathogenese der Erkrankung Osteoarthrose voraus.
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle des Wasserkanals AQP1 im humanen arthrotisch veränderten Knorpelgewebe auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene zu untersuchen. Zur Durchführung der Untersuchungen wurden Chondrozyten aus Spenderpräparaten von Patienten mit Osteoarthrose des Kniegelenkes isoliert. Im Folgenden wurden die Chondrozyten mittels RNA-Interferenz-Technologie (RNAi) nukleofiziert, um das für AQP1 codierende Gen herunter zu regulieren (Knockdown). Der erfolgreiche Knockdown konnte auf RNA-Ebene durch den Einsatz der qRT-PCR und auf Proteinebene in der Immunzytologie verifiziert werden. Anschließend wurden die Auswirkungen des Knockdowns auf bekannte Indikatoren des anabolen (Kollagen Typ I, II und IX) sowie katabolen (MMP-9, MMP-13, ADAMTS-4, und ADAMTS-5) chondrozytären Stoffwechsels und auf weitere Parameter (Lin-2, Periostin, SOX9) mit Hilfe der qRT-PCR untersucht. Die Ergebnisse zeigten keine statistische Signifikanz. Unter anderem waren die Populationsvarianzen zu stark ausgeprägt. Die Untersuchung eines homogeneren Genpools und von Vergleichspräparaten knorpelgesunder Gewebespender, unter Berücksichtigung weiterer zellspezifischer Parameter könnte eindeutigere Ergebnisse ermöglichen. Die Realisierung unterliegt jedoch einigen Limitationen (Materialmenge, personeller sowie materieller Aufwand).
Parallel zu den Untersuchungen zum Knockdown von AQP1 wurde mit den Arbeiten zur Etablierung eines Überexpressionsmodells des Gens in den verwendeten humanen Chondrozyten begonnen. Nach der RNA-Isolierung aus den Chondrozyten und Gewinnung von cDNA mittels reverser Transkription, konnte das AQP1-Fragment in der PCR erfolgreich amplifiziert werden. Anschließend gelang es, nach Testung verschiedener Ligationsvarianten und Vektoren, mit der TA-Klonierung das AQP1-Fragment in den Vektor pGEM®-T Easy einzufügen und in E. coli-Bakterien zu transformieren. Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit der Grundstein für weiterführende Untersuchungen mit dem Ziel der Überexpression von AQP1 in humanen Chondrozyten und der Beobachtung seiner Auswirkungen gelegt.

Kurzfassung auf Englisch: Osteoarthritis (OA) is the most prevalent joint disease worldwide. The pathogenesis of OA is multifactorial and strongly associated with increasing age. The treatment options are still limited to the pharmacological management of pain and inflammation and to surgical interventions including joint replacement surgery, respectively. There is a need for disease-modifying drugs to manage the increasing societal impact of OA considering the demographic transition. The keypoint is a better understanding of OA pathogenesis.
The aim of this work was to evaluate the role of the water transporting channel Aquaporin 1 (AQP1) in the pathogenesis of human OA. Experimental studies were performed applying molecular biological methods. Chondrocytes isolated from cartilage tissues of patients suffering from OA of the knee were nucleofected for silencing the gene expression of AQP1 (knockdown) by means of RNA interference technology (RNAi). After verification of a successful knockdown by real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) at the RNA-level and by immunocytochemistry at the protein-level the implications for anabolic (Collagen Type I, II and IX) and catabolic (MMP-9, MMP-13, ADAMTS-4, und ADAMTS-5) parameters of cellular metabolism as well as for related molecules (Lin-2, Periostin, SOX9) were analyzed by using qPCR. Unfortunately, statistical analysis detected no significant changes with respect to all expression levels. This result could be predominantly due to the marked variance of the study population. Creating a more homogeneous gene pool of patients with OA matched with tissues of healthy donors and observing a broader spectrum of biological parameters might be necessary to obtain a more specific OA pattern. The implemention, however, is limited by several factors e.g. the shortage of human cartilage tissue, manpower and material costs.
Simultaneously to the AQP1 knockdown analysis and to persue an alternative strategy, experiments have been conducted to establish an AQP1 overexpression model in human chondrocytes. After isolating RNA of the chondrocytes and assembling cDNA by reverse transcription, it was possible to amplify the AQP1 DNA-fragment using polymerase chain reaction (PCR). In a next step, different ligation methods and vectors have been tested. Applying TA-cloning and using the pGEM®-T Easy Vector the transformation of the AQP1 fragment into E. coli bacteria was successful. Thus, the basis for further investigations regarding AQP1 overexpression was created.
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