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Untersuchungen zur Lokalisation und Funktion des Orphan Carriers SLC10A5 in vitro und im Slc10a5-Knockout-Mausmodell

Aretz, Julia Silke


Originalveröffentlichung: (2015) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (9.888 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-117714
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11771/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6375-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.06.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 05.11.2015
Kurzfassung auf Deutsch: SLC10A5 wurde nach seiner Entdeckung aufgrund von Sequenzhomologie in die SLC10-Familie, auch Familie der Na+-abhängigen Gallensäuretransporter genannt, eingeordnet. Er wurde als potenzieller Gallensäuretransporter angesehen, da sich zusätzlich sein Expressionsprofil, das die höchsten Werte in Leber, Niere und Magen-Darm-Trakt zeigte, mit den gut charakterisierten Gründungsmitgliedern NTCP und ASBT überschnitt, welche zusammen den enterohepatischen Kreislauf der Gallensäuren aufrechterhalten. Jedoch wurde bislang keine Transportaktivität für Gallensäuren aufgezeigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig die Lokalisation und Funktion des SLC10A5 näher untersucht. Das SLC10A5-Protein von Mensch, Maus und Ratte wurde in transfizierten HEK293- und HepG2-Zellen intrazellulär im Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat nachgewiesen. Die Lokalisation auf subzellulärer Ebene konnte im Gewebe nicht abschließend geklärt werden, da zwei eingesetzte kommerzielle Antikörper gegen das humane SLC10A5-Protein keine spezifische Bindung aufwiesen und ein gegen den C-Terminus des SLC10A5 der Ratte generierter Antikörper in Immunhistologie- und Western-Blot-Analysen an Ratten- und Mausgewebe Mitochondrien markierte, jedoch auch mit dem Gewebe der Slc10a5-Knockoutmaus reagierte. In vitro konnte an mit humanem SLC10A5-V5-transfizierten HEK293-Zellen weder mit radioaktiv- noch mit fluoreszenzmarkierten Gallensäuren eine Transportfunktion nachgewiesen werden.
Mit der Slc10a5-Knockout-Maus (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) stand jedoch ein In-vivo-Modell zur Aufklärung der physiologischen SLC10A5-Funktion zur Verfügung. Unter Standardhaltungsbedingungen zeigten die homozygot-defekten Mäuse allerdings keinen auffälligen Phänotyp, sondern waren trotz geringfügig geringeren Körpergewichts gesund und fertil. Durch einwöchige Fütterung mit 0,5 % Cholsäure-haltiger Diät konnten signifikante Unterschiede zwischen den Slc10a5-Knockout-Mäusen und den C57BL/6N-Kontroll-Mäusen induziert werden. Die Gallen- und Plasmazusammensetzung wurde mittels UHPLC-MS/MS bestimmt. Unter Kontrollfütterung glichen sich Gallemenge, Gallensäure-, Phospholipid und Cholesterinkonzentrationen und ließen sich durch die Fütterung mit Cholsäure bei beiden Genotypen erhöhen. Jedoch schieden die Knockout-Mäuse bei gleicher Gesamtgallensäurekonzentration zwanzig Mal soviel unkonjugierte Gallensäuren wie die Wildtypmäuse aus, was auf eine begrenzte Fähigkeit hindeutet, Gallensäuren zu rekonjugieren. Zusätzlich verschob sich das bei Kontrollfütterung zwischen den Genotypen gleiche Verhältnis der Gallensäuren mit Taurocholat, Tauromurocholat, Tauro-7-Deoxycholat und Taurodeoxycholat als Hauptgallensäuren durch die Fütterung mit Cholsäure. Taurocholat stellte weiterhin den größten Anteil dar, aber während bei den Wildtyp-Mäusen Taurodeoxycholat circa ein Viertel der Gallensäuren ausmachte, sank der Anteil bei den Knockout-Mäusen auf unter 1 %, welche dafür zu etwa einem Viertel Cholat und einen vermehrten (Tauro-)7-oxo-Deoxycholat-Gehalt aufwiesen. Einher gingen diese Cholsäure-induzierten Veränderungen mit einer Hyperämie und Schwellung des Dünndarms bei den Knockout-Mäusen.
Bei Standardhaltung der Slc10a5-Knockout-Mäuse konnten keine Unterschiede in der Genexpression von Gallensäuretransportern oder der in Synthese und Metabolismus involvierten Enzyme in einer genomweiten Array-Analyse der Leber-RNA detektiert werden. Die Cholsäurefütterung induzierte Anpassungen der Genexpression in beiden Genotypen, jedoch nur geringe Expressionsunterschiede zwischen den Knockout- und Wildtypmäusen, welche nicht in der Lage sind, den beschriebenen Phänotyp zu erklären. Ein Einfluss des SLC10A5 auf den Prozess der Rekonjugation von Gallensäuren in der Leber ist somit wahrscheinlich, jedoch muss seine physiologische Funktion – auch in den anderen hoch-exprimierenden Geweben – weiter aufgeklärt werden.
Kurzfassung auf Englisch: After its discovery SLC10A5 was classified as a member of the SLC10-family (family of sodium-dependent bile acid transporters) due to sequence homology. It was regarded as a potential bile acid transporter because its expression profiles, showing the highest expression in liver, kidney, and the gastro intestinal tract, greatly overlapped with NTCP and ASBT that together build up the enterohepatic circulation of bile acids. However, no transport activity for bile acids has been shown yet.
In the present thesis the localization and function of SLC10A5 was examined for the first time. The SLC10A5 protein of human, mouse, and rat was sorted intracellular into the endo-plasmic reticulum and the golgi apparatus when transiently transfected in HEK293 and HepG2 cells. Subcellular localization could not be finally evaluated due to unspecific binding of two commercial antibodies. In addition, a custom made antibody raised against the C-terminus of the rat‘s SLC10A5 protein specifically marked mitochondria in immunohistology and Western Blot analysis of rat and mouse tissue but also reacted with tissue of the Slc10a5 knockout mouse. In vitro no transport function in SLC10A5-V5 transfected HEK293 cells could be observed, neither with radioactive nor fluorescent bile acids.
However, the Slc10a5 knockout mouse (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) represented an in vivo model to study the physiological function of SLC10A5. Under standard conditions the homozygous knockout mice showed no phenotype though, but were instead healthy and fertile with only slightly decreased body weight. One week of 0.5 % cholic acid feeding induced significant differences between the Slc10a5 knockout mice and the C57BL/6N control strain. Bile and plasma composition was measured by UHPLC-MS/MS. Fed the control diet, the total amount of bile, bile acid, phospholipid and cholesterol concentrations were similar in both genotypes but increased with cholic acid feeding. Cholic acid fed Slc10a5 knockout mice, however, excreted 20-fold more unconjugated bile acids into the bile than the wildtype control group, although the overall bile acid concentration of the bile was identical between both strains, pointing to limited bile acid reconjugation. Furthermore, the equal ratio of bile acids between the different genotypes during control diet feeding (with taurocholate, tauromurocholate, tauro-7-oxo-cholate, and taurodeoxycholate as main bile acids) shifted after cholic acid feeding. Taurocholate still made up for the main proportion of bile acids, but while taurodeoxycholate counted for one fourth of total bile acids in the wildtype mice the amount decreased to less than 1 % in the knockout mice. Instead, the knockout mice excreted about one fourth unconjugated cholate und increased amounts of (tauro) 7-oxo-deoxycholate. These observations went together with cholic acid induced hyperaemia and swelling of the small intestinal wall of the knockout mice.
Under standard conditions no differences in gene expression of bile acid transporters or enzymes involved in synthesis and metabolism of bile acids were detected using a whole genome array analysis of liver RNA. Cholic acid feeding induced changes in both genotypes with slight differences between knockout and wildtype mice, but could not explain the indicated phenotype of knockouts. This leads to the hypothesis that SLC10A5 is involved in the reconjugation of bile acids in liver. However, its physiological role – also in the other highly expressing tissues – has to be further examined.
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