Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Etablierung von micro-RNA Microarrays und deren Verwendung zur Analyse hypoxieinduzierter Regulation in humanen Fibroblasten der pulmonalvaskulären Adventitia

Dombrowski, Tobias


Originalveröffentlichung: (2015) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.360 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-117618
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11761/

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us


Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pathologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6370-2
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 06.11.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die pulmonalarterielle Hypertonie ist durch eine chronische Druckerhöhung des pulmonal-arteriellen Mitteldruckes gekennzeichnet. Pathogenetisch bedeutsam ist die Trias von Vasokonstriktion, Thrombose und Gefäßumbauprozessen (Remodelling) in den Pulmonalgefäßen. Die Erkrankung führt zu Belastungsdyspnoe, Cor pulmonale und Rechtsherzdekompensation. In der Frühphase der Erkrankung spielen pathogenetische Prozesse in pulmonalvaskulären Fibroblasten der Adventitia vermutlich eine wichtige Rolle. Die Beteiligung von microRNAs (miRNAs) hierbei ist kaum untersucht.
Die Ziele dieser Arbeit gliedern sich in mehrere Schritte. Zunächst soll eine möglichst robuste Plattform für das Labelling, die Hybridisierung und die Auswertung von miRNA-Microarrays etabliert werden. Im Anschluss sollen humane pulmonalarterielle Fibroblasten auf die Regulation von miRNAs unter 24h Hypoxie untersucht werden. Die zelluläre Antwort auf miRNA-Ebene soll schließlich mit bekannten Faktoren des adven-titiellen Remodellings von Pulmonalarterien bei pulmonalearterieller Hypertonie ver-knüpft werden.
Fibroblasten humaner Pulmonalarterien wurden kultiviert und für 24h unter Normoxie oder Hypoxie (FiO2=1%) inkubiert. Mit einer Phenol-Guanidin-basierten Methode erfolgte die Extraktion der gesamten RNA. Der Erfolg der Hypoxie-Stimulation wurde durch die Messung des Gens PGK1 mittels Real-Time-PCR bestätigt. Die miRNA wurde mit Hilfe einer T4-Ligase an einen Cy-Farbstoff-konjugiertes Oligoribonukleotid gebunden. Die farbstoffmarkierten miRNAs wurden nach Vergleich verschiedener Microarray-Hersteller auf miChip-Microarrays hybridisiert. Die Validierung der miRNA-Expression erfolgte mittels qRT-PCR. Zur Datenverarbeitung wurde die Software R verwendet. Die miRNA-Zielgenvorhersage und Verknüpfung mit KEGG-Signalwegen erfolgte gestützt auf einen selbst entwickelten Algorithmus. Dessen Ergebnisse wurden mit der KEGG-Signalweg-Analyse basierend auf Agilent Whole Genome Microarrays verglichen.
In der Etablierungsphase ergab die vergleichende Durchführung verschiedener Me-thoden Vorteile für T4-Ligase-vermitteltes Labelling auf miChip Microarrays. Die Microarray-Analyse ergab dass Hypoxie in den untersuchten Fibroblasten miR-210, -744 und -296 induzierte, und miR-183 supprimierte. Die qRT-PCR validierte mit Aus-nahme von miR-296 die Regulation der identifizierten miRNAs signifikant. Die kompa-rative Signalweg Analyse ermittelte etwa 60% der durch den entwickelten Algorithmus vorhergesagten Signalwege auch über mRNA-Microarrays.
Insbesondere miR-210, eine wichtige HIF-1alpha-/-2alpha-induzierte und bekannt hypoxie-regulierte miRNA, jedoch auch miR-183 und -744 können über ihre Zielgene mit pa-thogenetischen Mechanismen der PAH wie Angiogenese, Remodelling, Zelldifferenzie-rung und Zellzyklusarrest verknüpft werden. Ihre Bedeutung im Zusammenhang mit pulmonalarterieller Hypertonie war bisher unbekannt und führt gleich zu mehreren po-tentiellen Ansätzen weiterführender Forschung. Der entwickelte Algorithmus zur Sig-nalweganalyse basierend auf miRNA-Microarrays zeigt vergleichbare Ergebnisse zur Signalweganalyse über mRNA-Microarrays und ist damit eine interessante Möglichkeit zur weiterführenden Betrachtung des biologischen Kontexts von miRNA-Microarray-Ergebnissen.
Kurzfassung auf Englisch: Pulmonary arterial hypertension is a disease characterized by chronic elevation of pulmonary arterial mean pressure. Driven by the triad of vasoconstriction, thrombosis and vascular remodeling of the pulmonary artery, the disease leads to incipient dyspnea and finally to right heart failure. At the early pathogenesis, the vascular adventitial fibroblasts seem to play a crucial role. Here, the participation of microRNAs (miRNAs) is yet poorly understood.
Aims of this work are at first the establishment of a robust miRNA-Microarray plat-form including labelling, hybridization and data analysis. Afterwards miRNA-profiles of human pulmonary arterial fibroblasts were measured to link them to known mecha-nisms of pulmonary arterial vascular remodeling.
Fibroblasts from pulmonary arteries of a healthy human lung were cultured and kept under normoxic and hypoxic (FiO2=0.01) conditions for 24h. Total RNA was isolated using a phenol-/guanidine-based method. Success of the hypoxic treatment was con-firmed by measuring the expression of the PGK1 gene by quantitative real-time PCR. The miRNA was labelled by T4-Ligase-mediated linking of Cy-Dye-conjugated oligori-bonucleotides. Labelled miRNAs were hybridized to miChip after comparison of differ-ent microarray suppliers. Validation of miRNA expression levels was done with qRT-PCR. R software for statistical computing was used for data analysis. miRNA target prediction and KEGG pathway analysis were performed with in-house target-weighting-algorithms. Results were compared with KEGG pathway analysis based on Agilent Whole Genome microarrays.
The comparison of different workflows reveals advantages for T4-ligase-mediated labelling and miChip microarrays. MiR-210, -744 and -296-5p were found to be upregu-lated whilst miR-183 was downregulated in response to hypoxia in microarrays. qRT-PCR validated each significantly, whereas miR-296-5p was only significant at 10% level. Comparative pathway analysis revealed more than 60% of pathways predicted by our scoring algorithm enriched in mRNA-microarray’s pathways.
Since the HIF-1alpha- and -2alpha-induced miR-210 is a major hypoxia-regulated miRNA, its regulation confirms the validity of our results. However, none of the regulated miRNAs has yet been linked to hypoxia in PAH but can be connected to pathogenetic mecha-nisms as angiogenesis, remodelling, cellular differentiation and cell cycle arrest by miRNA target analysis. This leads to several possible anchors for future research. The pathway prediction based on weighting algorithms seems to be a viable approach as its results are comparable to results based on real mRNA expression data.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand