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Charakterisierung der Interaktion von K-Ras mit Galektin-8 und deren Einfluss auf die Signaltransduktion von Karzinomzellen

Characterisation of the interaction of K-Ras and Galectin-8 and their impact on signal transduction in carcinoma cells

Barnard, Sarah-Jane


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-114995
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11499/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Molekulare Onkologie solider Tumore
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 16.06.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Aktivierende, onkogene Punktmutationen in ras Genen treten in 30 % aller humanen Tumoren auf. K-ras weist die höchste Mutationsrate auf und betrifft 90 % aller Pankreaskarzinome. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion zwischen K-Ras und Galektin-8, einem in der Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartner, sowie der Einfluss von Galektin-8 auf die Aktivität der Kinasen Akt und ERK und auf die K-Ras-induzierte Migration untersucht.
In HEK293 Zellen konnte Galektin-8 mit EGFP-K-Ras(G12V) und EGFP-K-Ras(S17N) nach ektoper Expression der Proteine ko-immunpräzipitiert werden. Dies zeigt, dass K-Ras unabhängig seines Aktivierungszustandes mit Galektin-8 interagiert. Das Fehlen der posttranslationalen Farnesylierung von K-Ras hingegen führte dazu, dass Galektin-8 nicht im Komplex mit K-Ras ko-immunpräzipitiert wurde. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Farnesylgruppe für die Interaktion von K-Ras mit Galektin-8 essentiell ist. Daraus ergab sich die Frage, welche strukturellen Eigenschaften in Galektin-8 für die Bindung der Farnesylgruppe verantwortlich sein könnten. Durch in silico Analysen der Sekundärstrukturen der Galektin-8 N- bzw. C-terminalen CRD wurden Bereiche identifiziert, die hydrophobe Bindungstaschen für die Farnesylgruppe des K-Ras ausbilden könnten. Diese Taschen beinhalten 6 Aminosäuren, von denen bekannt ist, dass sie für die Interaktion der Farnesylgruppe des H-Ras mit der hydrophoben Tasche von Galektin-1 von Bedeutung sind.
Neben der Interaktion mit K-Ras wurde die Regulierung des Galektin-8 Proteingehalts in PANC-1 Zellen analysiert. Durch die Inkubation der Zellen mit pharmakologischen Inhibitoren, die die Phosphorylierung der Kinasen MEK1, MEK2, PI3K, Akt und mTOR oder die katalytische Aktivität von p38 hemmten konnte gezeigt werden, dass die Expression von Galektin-8 durch den MEK/ERK- und mTOR-Signaltransduktionsweg reguliert wird.
In der Transformation verschiedener Zelltypen und Tumorgenese spielen die Ras-abhängigen Signaltransduktionswege Raf/MEK/ERK und PI3K/Akt eine bedeutende Rolle. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Galektin-8 auf die Phosphorylierung von Akt2 und ERK1/2 in PANC-1 Pankreaskarzinomzellen untersucht. Die siRNA-vermittelte Inhibierung der Galektin-8 Expression resultierte in einer gesteigerten Phosphorylierung von Akt2 und ERK1/2, während eine reduzierte Galektin-3 Expression die Phosphorylierung von ERK1/2 erhöhte, aber keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von Akt2 hatte. Die stabile Expression von EGFP-K-Ras(G12V) verstärkte die Phosphorylierung von Akt2 in Zellen, die mit siRNAs gegen Galektin-8 und -3 transfiziert worden waren. Die Überexpression von ECFP-Galektin-8 führte zu keiner veränderten EGFP-K-Ras(G12V)-induzierten HA-ERK2 Phosphorylierung.
In den Lungenadenokarzinomzelllinien A549 und A427 führte eine verminderte Galektin-8 Expression durch siRNAs zu keiner Änderung der Phosphorylierung von Akt1 und ERK1/2. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass in diesen Zellen weder der PI3K/Akt- noch der Raf/MEK/ERK-Signalweg durch Galektin-8 reguliert wird.
Um den Einfluss von Galektin-8 auf die Migration von PANC-1 Zellen zu untersuchen, wurden Wounding-Assays durchgeführt. Zellen, die zuvor mit Gal-8 siRNAs transfiziert worden waren, zeigten einen um 20-25 % verringerten Wundverschluss verglichen mit Zellen, die mit einer Kontroll-siRNA transfiziert worden waren.
In Immunoblotanalysen nach subzellulären Fraktionierungsexperimenten von PANC-1/EGFP-K-Ras(G12V) Zellen wurden endogenes Galektin-8 und Ras sowie EGFP-K-Ras(G12V) in der partikulären Fraktion detektiert. Die Membranlokalisierung konnte fluoreszenzmikroskopisch für EGFP-K-Ras(G12V), nicht aber für ektopes ECFP-Galektin-8 bestätigt werden.

In der vorliegenden Arbeit konnte die Relevanz der Farnesylgruppe für die Interaktion zwischen K-Ras und Galektin-8 sowie die Auswirkungen von Galektin-8 als Regulator der K-Ras-induzierte Phosphorylierung von Akt und ERK als auch auf die Migration von PANC-1 Zellen beschrieben werden.
Kurzfassung auf Englisch: Activating, oncogenic point mutations in ras genes occur in 30 % of all human tumours. A K-ras mutation was found in 90 % of all pancreatic carcinomas. In the present study the interaction between K-Ras and Galectin-8, an in our group identified interacting partner, as well as the influence of Galectin-8 on the activity of the kinases Akt and ERK and the K-Ras-induced migration was analysed.
In HEK293 cells Galectin-8 was co-immunoprecipitated with ectopically expressed EGFP-K-Ras(G12V) and EGFP-K-Ras(S17N). These experiments revealed that K-Ras interacted with Galectin-8 fully independent of its activation state. In contrast, the lack of the posttranslational farnesylation of K-Ras showed that Galectin-8 was not co-immunoprecipitated in a complex with K-Ras. This study demonstrated the importance of the farnesylation for the interaction between K-Ras and Galectin-8 and raised the question what structural characteristics in Galectin-8 are responsible for the interaction. In in silico analyses of the secondary structure of the Galectin-8 N- and C-terminal CRD respectively, structures were identified that may form hydrophobic pockets in which the farnesyl group could bind. These pockets comprise 6 amino acids known to be relevant for the interaction between the H-Ras farnesyl group and the hydrophobic pocket of Galectin-1.
Additionally the regulation of the Galectin-8 protein content in PANC-1 cells was investigated. The cells were incubated with pharmacological inhibitors that prevent the phosphorylation of the kinases MEK1, MEK2, PI3K, Akt, and mTOR or the catalytic activity of p38. These results lead to the conclusion that the expression of Galectin-8 is regulated through MEK/ERK and mTOR.
The Ras-dependent signal transduction pathways Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt play an important role during transformation of different cell types and tumourigenesis. In the present study the influence of Galectin-8 on the phosphorylation of Akt2 and ERK1/2 in PANC-1 cells was examined. The siRNA-induced inhibition of the Galectin-8 expression resulted in an increased phosphorylation of Akt2 and ERK1/2 whereas a reduced Galectin-3 expression increased the phosphorylation of ERK1/2 but had no influence on the phosphorylation of Akt2. Stably expressed EGFP-K-Ras(G12V) further increased the phosphorylation of Akt2 in cells transfected with siRNAs against Galectin-8 and -3. Overexpression of Galectin-8 had no impact on the EGFP-K-Ras(G12V)-induced phosphorylation of HA-ERK2.
A siRNA-mediated reduced Galectin-8 expression in A549 and A427 lung adenocarcinomas cell lines showed no alterations in the phosphorylation of Akt1 and ERK1/2. These experiments suggested that neither the PI3K/Akt nor the Raf/MEK/ERK pathway is regulated by Galectin-8 in these cell lines.
Wounding assays were performed to investigate the influence of Galectin-8 on the migration of PANC-1 cells. Cells transfected with siRNAs against Galectin-8 exhibited a 20-25 % decelerated wound closure compared to cells transfected with control siRNA.
Immunoblot analyses after subcellular fractionation of PANC-1/EGP-K-Ras(G12V) cells demonstrated a particulate localisation of Galectin-8, Ras and, EGFP-K-Ras(G12V). By using fluorescence microscopy the membrane localisation of EGFP-K-Ras(G12V) but not ECFP-Galectin-8 was confirmed.

In the present study the relevance of the farnesyl group for the interaction between K-Ras and Galectin-8 was demonstrated. Furthermore the impact of Galectin-8 as a regulator of the K-Ras-induced phosphorylation of Akt and ERK as well as the influence on migration of PANC-1 cells were described.
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