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Die Beteiligung der extrazellulären Matrix an der Mechanosensitivität des humanen Epithelialen Na+-Kanals (ENaC)

Knöpp, Fenja


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-113590
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11359/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): ENaC , Scherkraft , extrazelluläre Matrix , Mechanosensitivität
Freie Schlagwörter (Englisch): ENaC , shear force , extracellular matrix , mechanosensitivity
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierphysiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 02.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Der aus drei Untereinheiten (abg oder dbg) zusammengesetzte epitheliale Na+-Kanal (ENaC) wird sowohl in epithelialen als auch nicht-epithelialen Zellen exprimiert. Seine Aktivität wird u.a. durch Scherkraft (SK) reguliert, die z.B. durch den Fluss des Primärharns in der Niere oder den Blutstrom entsteht. Obwohl die Mechanosensitivität des ENaC damit für essentielle physiologische Prozesse wie die Blutdruckregulation von Bedeutung sein könnte, ist der molekulare Mechanismus der SK-Detektion bisher unbekannt. Die Aufklärung dieses Mechanismus war Gegenstand der vorliegenden Dissertation. Die Untersuchungen basierten auf der Hypothese, dass die großen Extrazellulären Domänen der ENaC-Untereinheiten innerhalb der Extrazellulären Matrix (EZM) verankert sind. Sollte solch eine Verankerung für die SK-Detektion des ENaC notwendig sein, müsste sowohl der Abbau der EZM, als auch der Verlust der Anknüpfungsstellen zwischen ENaC und EZM zu einer reduzierten SK-vermittelten Aktivierung des ENaC im Vergleich zur Kontrolle führen. Um dies zu überprüfen, wurden der humane abg- und dbgENaC heterolog in Oozyten des Xenopus laevis exprimiert, SK in physiologisch relevanten Größenordnungen (von 0,001 bis 1,3 dyn/cm2) ausgesetzt und der daraus resultierende Anstieg des ENaC-vermittelten Stromes (SK-Effekt) mittels der TEVC-Technik bestimmt. Beide Kanäle wurden durch SK repetitiv und dosisabhängig aktiviert. Der SK-Effekt des abgENaC war jedoch - bei gleicher SK-Rate - deutlich stärker und konträr zum SK-Effekt des dbgENaC vollständig reversibel.
Um die Beteiligung der EZM an der SK-Detektion zu untersuchen, wurde diese mechanisch (Devitellinisierung) und/oder enzymatisch (Elastase, bzw. Hyaluronidase) abgebaut. Der Abbau der EZM wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie überprüft und der SK-Effekt des in diesen Oozyten exprimierten ENaC mit demjenigen in unbehandelten (Kontroll)-Oozyten verglichen. Während weder eine Beteiligung der Vitellinhülle, noch von Elastin am SK-Effekt nachgewiesen werden konnte, verringerte sowohl eine Inkubation devitellinisierter Oozyten in Hyaluronidase, als auch dessen akute Zugabe den SK-Effekt des abgENaC. Hyaluronidase induzierte zudem eine unmittelbare Abnahme des ENaC-vermittelten Stromes, welche mutmaßlich auf den Abbau von EZM-Komponenten und damit den Verlust der SK-vermittelten Aktivierung zurückzuführen war. So wurde erstmals eine Beteiligung der EZM an der SK-Detektion des abgENaC nachgewiesen. Eine identische Behandlung dbgENaC-exprimierender Oozyten mit Hyaluronidase beeinflusste den SK-Effekt dieses Kanals nicht. Dies implizierte, dass potentielle Verknüpfungen des ENaC zur EZM in der a-, bzw. d-Untereinheit lokalisiert sein müssten (da b und g jeweils identisch waren).
Um Verknüpfungspunkte der a-, bzw. d-Untereinheit zur EZM zu lokalisieren, wurden mutmaßlich glykosylierte Asparagine, die über angehängte Zuckerketten eine Verbindung zur EZM aufbauen könnten, via zielgerichteter Mutagenese durch Alanine substituiert. Diese Asparagin-Mutanten wurden (mit b und g) in Oozyten exprimiert und ihr SK-Effekt mit demjenigen des jeweiligen Wildtyp-ENaC (Wt) verglichen. Für die d-Untereinheit konnte so keine für die SK-Detektion notwendige Verbindung zur EZM nachgewiesen werden. Demgegenüber wurden innerhalb der a-Untereinheit zwei Asparagine (N312 und N511) identifiziert, die über ihre Glykosylierung eine für die SK-Detektion notwendige Verknüpfung zur EZM ausbilden, da der SK-Effekt der Einzel-Mutanten im Vergleich zum Wt signifikant vermindert und bei gleichzeitiger Mutation beider Asparagine (Doppel-Mutante aN312+511Abg) weiter reduziert war. Der reduzierte Glykosylierungsstatus der Asparagin-Mutanten wurde mittels Western Blot nachgewiesen, die genaue Position und Orientierung der Asparagine innerhalb der Proteinstruktur via Homologie-Modelling visualisiert. Mittels Einzelkanal-Ableitungen wurde gezeigt, dass die reduzierte Glykosylierung der Doppel-Mutante die Einzelkanaleigenschaften (Leitfähigkeit, Strom-Amplituden bzw. Offenwahrscheinlichkeit) nicht beeinflusste. Auch eine beeinträchtigte Expression der Doppelmutante konnte ausgeschlossen werden, da sich die Höhe des ENaC-vermittelten Stromes in Abwesenheit von SK nicht von dem des Wt unterschied und so auf eine vergleichbare Anzahl aktiver Kanäle hindeutete.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sowohl abg- als auch dbgENaC mechanosensitive Kanäle bilden, die SK-vermittelte Aktivierung des dbgENaC jedoch vermutlich nicht über eine Verknüpfung der d-Untereinheit mit der EZM erfolgt. Für den abgENaC konnte hingegen nicht nur die zentrale Bedeutung der EZM in Bezug auf die Mechanosensitivität des Kanals, sondern auch die detaillierte Lokalisation der Verbindungsstellen zwischen a-Untereinheit und EZM nachgewiesen werden. Auf diese Weise konnte erstmals der molekulare Mechanismus der SK-Detektion des abgENaC - zumindest im Xenopus Expressionsmodell - identifiziert und charakterisiert werden.
Kurzfassung auf Englisch: The epithelial Na+-channel (ENaC) is composed of three homologous subunits (either a or d with b and g) and expressed in both epithelial and non-epithelial cells. Amongst various factors, ENaC activity is regulated by shear force (SF). SF is elicited e.g. by the urinary flow in the kidney or the bloodstream and is regarded as suitable stimuli for ENaC-activation. Although the mechanosensitivity of ENaC could therefore be involved in the regulation of distinct physiological processes, the molecular mechanism of SF-sensing by ENaC is yet unknown. The aim of the present dissertation was to characterize this mechanism. It was hypothesized that the large extracellular domains of ENaC are anchored to the extracellular matrix (ECM). If either intact ECM or linkage between ENaC and ECM were necessary for SF-sensing of ENaC, both the degradation of the ECM and a disrupted linkage should result in a lowered SF-induced ENaC-activation compared to control. To this end, human abg- and dbgENaC were heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes and subjected to SFs in physiological relevant ranges (from 0.001 to 1.3 dyn/cm2). The SF-induced increase of ENaC-mediated current (SF-effect) was determined by the two-electrode voltage-clamp technique. Both channels were repetitively and dose-dependently activated by SF. At identical SF rates, the SF-effect of abgENaC was significantly stronger than that of dbgENaC and completely reversible as opposed to the SF-effect of dbgENaC.
The impact of ECM in SF-sensing of ENaC was examined by its mechanical (devitellinization) and/or enzymatic (elastase or hyaluronidase) degradation. The degradation was further confirmed by scanning electron microscopy. SF-effect of ENaC, expressed in these oocytes upon mechanical or enzymatic treatment, was determined and compared to those of untreated (control) oocytes. Neither the vitelline envelope nor elastin was involved in SF-effect of abg and dbgENaC. In contrast, both the incubation of devitellinized oocytes as well as the acute treatment with hyaluronidase lowered SF-effect of abgENaC. Additionally, application of hyaluronidase induced an immediate decrease of ENaC-mediated current which was presumably due to degradation of the ECM and thus the lack of SF-mediated ENaC activation. In conclusion, the participation of the ECM in SF-sensing of abgENaC has been shown for the first time. In contrast, identical treatment of dbgENaC-expressing oocytes with hyaluronidase failed to impair SF-effect of this channel, implying that putative connection points between ENaC and ECM may be localized within the a- or d-subunit, respectively (since b and g were identical between both channels).
In general, sugar chains of N-glycosylated asparagines represent suitable linkages of proteins to the ECM. In order to determine putative connection-points of a- and d-subunit to the ECM, presumably glycosylated asparagines within the extracellular domains of a- and d-subunit were substituted for alanines. These asparagine-mutants were subsequently expressed in combination with b- and g- subunits in Xenopus oocytes and their SF-effect compared to those of wild-type ENaC (abg or dbg). By this approach, no linkage of d-subunit to the ECM involved in SF-sensing of dbgENaC was detected. In contrast, two asparagines (N312 and N511) within the extracellular domain of the a-subunit were identified whose glycosylation was essential for SF-dependent activation of ENaC. SF-effect of those single-asparagine mutants was significantly reduced with respect to wild-type and further diminished by a combined mutation of both asparagines (double-mutant aN312+511Abg).
As glycosylation-deficient mutants differ in molecular weight from wild-type, band-shifts were detected in western blots. The detailed localization and orientation of asparagines within the tertiary structure of the a-subunit was explored via homology modeling. Single channel recordings in the cell attached configuration revealed that single channel properties (conductance, amplitudes and open-probability) of the double-mutant were equal to those of wild-type. Additionally, an impaired membrane expression of the double-mutant was excluded, since ENaC-mediated current did not differ from those of wild-type in the absence of SF - referring to a comparable number of active channels at the cell-surface.
In conclusion, both abg and dbgENaC are mechanosensitive ion channels, but SF-mediated activation of dbgENaC is presumably not dependent on a linkage of the d-subunit to the ECM. Moreover, for abgENaC not only the pivotal role of ECM in mechanosensitivity of abgENaC, but also the existence and detailed localization of connection-points to the ECM were established. Overall, the underlying mechanism of SF-dependent activation of abgENaC - at least in the Xenopus expression system - was identified and characterized for the first time.
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