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Beschreibung der intrazellulären Lokalisation der Wildtyp-RDH5 und mutierter RDH5 im Vergleich zum RLBP1

Weber, Julia


Originalveröffentlichung: (2014) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.699 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-112681
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11268/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6262-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.11.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 22.01.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Der Retinolzyklus in den retinalen Pigmentepithelzellen dient der Wiederherstellung des Retinoids 11-cis-Retinal, das für den Sehvorgang des menschlichen Auges essentiell ist. Am Retinolzyklus sind die Proteine RDH5 und RLBP1 beteiligt, die miteinander interagieren. Mutationen im RDH5-Gen führen zu einer verminderten Produktion des Retinoids 11-cis-Retinal und einer Akkumulation der Vorstufe 11-cis-Retinol, welches zu 11-cis-Retinylestern verstoffwechselt wird, die vermutlich in Retinosomen gespeichert werden. Phänotypisch äußert sich die Mutation im RDH5-Gen durch weiße Flecken am Fundus der Patienten, dem Fundus albipunctatus, der zur Nachtblindheit führt.
Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen, ob die mutierte RDH5 eine veränderte intrazelluläre Lokalisation im Vergleich zur Wildtyp-RDH5 besitzt, die eine Interaktion mit RLBP1 verhindern würde und so für die verminderte Produktion des Retinoids 11-cis-Retinal verantwortlich sein könnte. In dieser Arbeit wurden die beiden Punktmutationen p.G238W und p.A294P im RDH5-Gen auf molekularer Ebene untersucht.
Zunächst wurde mittels RT-PCR die DNA des RDH5- und RLBP1-Gens aus humaner RNA gewonnen. Die Gene wurden zuerst in pCR®2.1-TOPO®-Vektoren und anschließend in pcDNA3.1+-Expressionsvektoren kloniert. Durch eine Mutagenese-PCR wurden die Punktmutationen p.G238W und p.A294P in das RDH5-Gen eingefügt. Die heterologe Expression der Wildtyp-Gene und der mutierten RDH5-Gene wurde in der humanen HEK293T-Zelllinie überprüft. Nachdem die dortige Expression gelungen war, wurde die intrazelluläre Lokalisation der Proteine in HeLa-Zellen untersucht.
Die Lokalisation der RDH5-Mutanten wurde mit der der Wildtyp-RDH5 verglichen. Sowohl die RDH5-Mutanten als auch die Wildtyp-RDH5 zeigten ein perinukleär akzentuiertes, gleichmäßiges, feinfleckiges Verteilungsmuster, das mit einer Lokalisation der RDH5 am Endoplasmatischen Retikulum vereinbar war. Im Gegensatz zur Wildtyp-RDH5 konnte bei den mutierten RDH5G238W und RDH5A294P jedoch zudem eine Akkumulation immunpositiven Materials im Bereich der Plasmamembran gezeigt werden. Aufgrund dessen wurde in dieser Arbeit die Vermutung aufgestellt, dass die mutierte RDH5 bevorzugt in der Plasmamembran und an den Retinosomen, die bei einer Mutation im RDH5-Gen vermehrt hergestellt werden, lokalisiert ist. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die intrazelluläre Lokalisation der Wildtyp-RDH5 und der RDH5-Mutanten mit der Lokalisation des RLBP1 verglichen. Die intrazelluläre Lokalisation von RLBP1 zeigte eine perinukleär betonte, netzartige Verteilungsstruktur und wurde dem Zytoskelett zugeordnet. Aufgrund der überlappenden intrazellulären Lokalisation wurde eine Interaktion zwischen der Wildtyp-RDH5 und dem RLBP1 ebenso wie zwischen den RDH5-Mutanten und dem RLBP1 am Endoplasmatischen Retikulum für möglich gehalten.
Kurzfassung auf Englisch: The visual cycle in the retinal pigment epithelium serves as a pathway for the regeneration of the retinoid 11-cis-retinal, which is essential for vision of the human eye. The proteins RDH5 and RLBP1 are components of the visual cycle. There is an interaction known between these two proteins. Mutations in the RDH5 gene lead to a reduced production of the retinoid 11-cis-retinal and an accumulation of its precursor 11-cis-retinol. 11-cis-retinol can be converted into 11-cis-retinyl esters, which presumably can be stored in retinosomes. Phenotypically the fundus of the patients with mutations in the RDH5 gene shows white spots. Therefore, the disease is called fundus albipunctatus. It leads to night blindness.
The aim of this work was to check whether a difference in the intracellular localization of the mutated RDH5 in comparison with the wild-type RDH5 could be shown, which would impede the interaction with RLBP1 and thus could be the reason for the reduced production of the retinoid 11-cis-retinal. In this work, the point mutations p.G238W and p.A294P in the RDH5 gene were examined at molecular level.
At first the DNA of the RDH5 and RLBP1 gene was obtained by RT-PCR of human RNA. Next, the genes were first cloned into pCR®2.1-TOPO®-vectors and after that into pcDNA3.1+-expression vectors. The point mutations p.G238W and p.A294P were inserted into the RDH5 gene by mutagenesis PCR. The heterologous expression of the wild-type genes and the mutated RDH5 genes was tested in the human HEK293T cell line. After the expression in the HEK293T cell line had been successful, the intracellular localization of the proteins was examined in the HeLa cells.
The intracellular localization of the mutated RDH5 was compared with the localization of the wild-type RDH5. Both the RDH5 mutants and the wild-type RDH5 showed a perinuclear accentuated, uniquely fine spotted pattern. This was compatible with the localization of the RDH5 in the endoplasmic reticulum. In contrast to the localization of the wild-type RDH5, the RDH5 mutants also showed an accumulation of immunopositive material in the plasma membrane. Due to this, it was assumed, that the RDH5 mutants were preferentially localized in the plasma membrane and the retinosomes. The production of the retinosomes seemed to be increased. Furthermore, the intracellular localization of the wild-type RDH5 and the RDH5 mutants was compared to the localization of RLBP1. The intracellular localization of the RLBP1 showed a perinuclear accentuated, netlike distribution pattern, which was assigned to the cytoskeleton. Because of the overlapping intracellular localization it can be considered possible that there is an interaction between the wild-type RDH5 and the RLBP1 as well as between the RDH5 mutants and the RLBP1, which takes place at the endoplasmic reticulum.
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