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Engineering der LAGLIDADG Homingendonukleasen

Engineering of LAGLIDADG Homingendonukleasen

Günther, Eva


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-112610
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11261/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.09.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 13.01.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die zielgerichtete Integration eines therapeutischen Gens ist eine viel versprechende Möglichkeit der Gentherapie, um vererbte oder erworbene monogenetische Krankheiten „heilen“ zu können. In den letzten Jahren wurden verschiedene TALE-, Zinkfinger- und Meganukleasen entwickelt, die einen adressierten DSB in die genomische DNA einfügen können. Durch die hochspezifische Spaltung mittels generierter Designernukleasen wird das wirtseigene Reparatursystem der HDR ausgelöst. Steht eine exogen eingefügte DNA zur Verfügung, kann das „defekte“ Gen zielgerichtet ausgetauscht werden. HE sind natürlich vorkommende Endonukleasen mit sehr langen Erkennungssequenzen von 14-40 Bp. Durch die Möglichkeit des Protein engineering können nicht nur bestimmte Eigenschaften wie die Spezifität und Aktivität der Enzyme verändert werden, sondern auch die Erkennung von neuen Zielsequenzen herbeigeführt werden.
In dieser Arbeit wurden dazu zwei verschiedene Ansätze von engineering an LAGLIDADG-HE verfolgt.

Zum einen wurde das Fusionsprotein Sce*2Cre* so weiterentwickelt, dass es auch unter physiologischen Bedingungen seine Erkennungssequenz spezifisch spalten kann. Das Enzym besteht in der dimeren Form aus der Fusion einer I CreI Variante (G19S), die von zwei inaktiven I-SceI Varianten (D44N/D145A) flankiert wird. Durch weitere Mutationen in der I-Cre* Spaltdomäne konnte Sce*2Cre*K139M;Y33C hergestellt werden. Dieses Enzym spaltet zwar die Zielsequenz unter physiologischen Bedingungen adressiert bzw. „spezifisch“, hat aber im Vergleich zum Wt Sce*2Cre* an Aktivität verloren. Weitere Tests zeigten, dass diese geringe Aktivität wahrscheinlich auf die kaum vorhandene Bindungsstärke der Spaltdomäne zurückzuführen ist und so lediglich die I-Sce*-Bindungsdomänen des Fusionsproteins für die Bindung essentiell sind. Dadurch könnten zwei DNA Fragmente auf einmal gebunden werden, was das Enzym in die Inaktivität führt. Um das erzeugte Fusionsprotein in der Gentherapie anwenden zu können, müsste es weiter verändert werden, was sehr zeitaufwendig ist. Da TALEN wesentlich einfacher und schneller zu programmieren sind, werden diese Nukleasen zukünftig eher in der Therapie am Genom des Menschen eingesetzt werden. Das in dieser Arbeit hergestellte Sce*2Cre*K139M;Y33C wäre aber ein optimaler Kandidat um dessen Erkennungssequenz in vivo eine sogenannte „safe harbour“-Stelle zu spalten. Denn mittlerweile werden I-SceI Erkennungssequenzen als Insertionsstellen für genetische Modifikationen in einer Auswahl von bestimmten Kulturpflanzen angewendet.

Zum anderen wurde in dieser Arbeit ein Bindungs-Assay entwickelt, der noch nicht ausgereift ist und durch weitere Untersuchungen auf seine Effizienz getestet werden könnte. Der Bindungs-Assay besteht aus einem Zwei-Plasmidsystem (Endo- sowie Target-Plasmid) und ist an eine blau/weiß-Selektion angelehnt. Das Endo-Plasmid kodiert für die inaktive I-CreI-Variante (I-Cret) oder eine Variante davon. Das Target Plasmid beinhaltet das lac-Operon mit einer I-CreI-Erkennungssequenz anstelle des Repressorgens. Wird eine Enzymvariante mit hoher Affinität zur Zielsequenz exprimiert, bleiben die E. coli-Zellen weiß. Wird dagegen eine Variante mit niedriger Affinität hergestellt wird beta-Galaktosidase exprimiert und die Zellen färben sich blau. Durch Analysen verschiedener Eigenschaften von Endo- und Target-Plasmiden mit den dazugehörigen Kontrollen konnte durch Kotransformation des high copy Target Plasmids mit dem middle copy Endo-Plasmid auf den Selektionsagarplatten 80/0,6 das gewünschte Ergebnis erzielt werden. Doch hat sich der Bindungs-Assay in weiteren Untersuchungen als nicht robust erwiesen und es müssten, um die Funktion des Assays verifizieren zu können, weitere Analysen durchgeführt werden.
Kurzfassung auf Englisch: Target-oriented integration of a therapeutic gene is the most promising possibility to heal bequeathed or acquired monogenetic diseases with gene therapy.
In the last few years different TALE-nucleases, Zincfingernucleases and Meganucleases were engineered to induce an addressed double strand break into genomic DNA. By highly specific cleavage using engineered nucleases the reparation system of the host released HDR. The “defect” gene can be changed in a precise way if there is a exogen DNA available. Meganucleases are natural endonucleases with very long recognition sequences 0f 14-40 bp length. Not only can protein engineering change certain properties like specificity activity of the enzymes, but also bring about recognition of new target sequences.
This study shows two different approaches of engineering LAGLIDADG-Homingendonucleases.

On the one hand the fusionprotein Sce*2Cre* has been developed further so as to be able to cleave its recognition sequence also in a specific manner also on physiological conditions. The enzyme is a dimer with a fusion of a I-CreI-variant (G19S) which is flanked by two inactive I SceI variants (D44N/D145A). Through further mutations in the I-CreI cleavage domain Sce*2Cre*K139M;Y33C has been generated. Althought this enzyme cleaves its target quite specifically on physiological conditions, in comparison to the wildtyp Sce*2Cre* it is less active. Other tests have shown that this low activity is probably due to the barely available force in the binding, caused by the cleavage-domain, so that only I-Sce* binding-domains of the fusionprotein are essential for the whole binding. Thereby two DNA-fragments could be bound at the same time, which makes the enzyme inactive. In order to be utilized in gene theraphy the generated fusionprotein would have to be changed again, bwhich is very time-consuming. As it is much easier and faster to program TALEN, these nucleases are more likely to be used in future therapy of the human genome. The generated Sce*2Cre*K139M;Y33C in this study would be an optimal candidate to use it in vivo as “safe harbour” to cleave its recognition site. For by now I-SceI recognition sequences are used as insertion sites for genetic modifications in a range of certain crops.

On the other hand in this study an embryonic binding-assay has been generated which could be analyzed in further investigations with regard to its efficiency. The binding-assay consists of a two-plasmidsystem (endo- and target-plasmid) and is based on a blue/white-selection.
The endo-plasmid codes for an inactive I-CreI-variant (I-Cret) or another variant of it. The target-plasmid contains a lac-operon with an I-CreI recognition sequence instead of genes for the repressor. If a variant of the enzyme get expressed, with a high affinity to its recognition sequence, the e. coli-cells remain white. If a variant with low affinity is produced, beta-Galaktosidase is expressed and the cells become blue.
By analysing different properties of endo- and target-plasmids with attendant controls the wished result could be reached through cotransformation of the high copy target plasmid and middle copy endo-plasmid on selection plates 80/0,6.
However, in further investigations the binding-assay has proven to be not robust, thus, in order to be able to verify the function of the assay, further analysis would have to be realized.
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