Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Charakterisierung der Aktivität von Proteasen aus dem Maden-Exkretions-Produkt von Lucilia sericata in der humanen Blutgerinnung als Teilprozess der Wundheilung

Kahl, Mareike


Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.781 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-110038
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/11003/

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us


Freie Schlagwörter (Deutsch): Wundheilung , Gerinnung , Kontaktphase , Lucilia sericata , Madentherapie
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.07.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 29.07.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Schon vor Jahrhunderten wurden Fliegenlarven, auch als Maden bezeichnet, als Teil der traditionellen Medizin von verschiedenen Kulturen eingesetzt. Mit vermehrtem Auftreten von Antibiotikaresistenzen und einer gleichzeitigen Zunahme chronischer Wunden wie z.B. solchen assoziiert mit diabetischen oder venösen Ulzera, rückte die Madentherapie in den 1980er Jahren wieder in den Fokus. In umfassende Untersuchungen konnten seit dem drei Hauptmechanismen identifiziert werden, über welche die Maden der Goldfliege Lucilia sericata ihre wundheilungsfördernden Eigenschaften vermitteln: (1) Das Wunddébridement, (2) antimikrobielle Wirkungen sowie (3) eine Stimulation des Heilungsprozesses. Der Einfluss von Maden-Exkretions-Produkten (MEP) auf das humane Gerinnungssystem als Teilreaktion der Wundheilung ist bislang weitgehend unerforscht. Die Aufdeckung gerinnungsfördernder Aktivitäten des MEP und eine Identifikation der aktiven Moleküle sowie deren weitere Charakterisierung könnte eine neue Perspektive der modernen biochirurgischen Behandlung chronischer Wunden eröffnen.
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels verschiedener optischer und mechanischer Methoden der Einfluss von MEP auf die Gerinnungszeit in humanem Plasma und Vollblut untersucht. Zur Charakterisierung der in MEP enthaltenen Protease-Aktivitäten wurden zudem unterschiedliche chromogene Substrate, Serinprotease-Inhibitoren und Mangelplasmen eingesetzt. Des Weiteren wurde der MEP-Gesamtextrakt fraktioniert und die generierten Pools auf ihre Protease-Aktivität und ihr prokoagulatorisches Potenzial untersucht mit dem Ziel einer Identifizierung der aktiven Moleküle und der Charakterisierung von deren Einfluss auf die humane Gerinnung.
Diese Arbeit zeigt, dass Serinproteasen im MEP von Lucilia sericata eine Kallikrein-Bypassing-Aktivität besitzen, so die Kontaktphasen-Proteine hochmolekulares Kininogen (HMWK) und Faktor XII (FXII) spalten, prokoagulatorische Effekte in humanem Plasma und Vollblut vermitteln und zudem die Gerinnungszeit in Mangelplasmen der Kontaktphasen-Proteine wieder herstellen. Die beobachtete Kallikrein-ähnliche Aktivität wurde dabei von Trypsin- und Chymotrypsin-ähnlichen Proteasen vermittelt und in Inhibitor-Studien zudem durch Kontaktphasen-Inhibitoren wie dem C1-Esterase-Inhibitor oder anderen FXIIa-spezifischen Inhibitoren vollständig gehemmt. Weiterhin konnte die Hauptaktivität drei Fraktionen zugeordnet werden. Massenspektrometrische Analysen und anschließende Datenbankabgleiche der in diesen Fraktionen enthaltenen Proteine erlaubten die Identifizierung eines möglicherweise an der Vermittlung der prokoagulatorischen MEP-Aktivität beteiligten Enzyms. Das Protein wurde in E.coli kloniert und mittels Dialyse renaturiert bevor Versuche zu seiner Aktivierung mit Trypsin-Agarose folgten. Tatsächlich zeigte das als “Jonah” bezeichnete Protein Serinprotease-Aktivität, diese war jedoch im Vergleich zum MEP-Gesamtextrakt gering. Aufgrund der ineffektiven Aktivierung des Proteins, konnte bislang im Clot-Lyse-Test kein Einfluss des Proteins auf die Gerinnungszeit von humanem Plasma festgestellt werden.
Neben der Charakterisierung von MEP Kallikrein-ähnlichen Protease-Cocktail mit prokoagulatorischer Aktivität wurde zudem weiterer Forschungsbedarf im Hinblick auf die multifunktionalen Aktivitäten von MEP aufgedeckt. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte spaltet MEP, wie auch Kallikrein, HMWK und eine mögliche Entstehung von Bradykinin und aktiviertem HMWK, sowie die Analyse von dessen Einfluss auf das Wundheilungsgeschehen ist ein interessanter neuer Ansatz in der Untersuchung der Mechanismen der Madentherapie.
Zusammenfassend zeigen die dargestellten Ergebnisse eine Beeinflussung der Blutgerinnung und tragen so zur Aufklärung der wundheilungsfördernden Wirkungen des MEP bei. Zudem konnte ein maßgeblich an der prokoagulatorischen Aktivität des MEP beteiligtes Enzym identifiziert werden, was einen ersten Schritt zum gezielten Einsatz dieses isolierten Moleküls im Rahmen einer modernen Biochirurgischen Anwendung darstellt.
Kurzfassung auf Englisch: For centuries maggots have been used for the treatment of wounds by a variety of cultures, as part of their traditional medicine. With increasing appearance of antimicrobial resistance and in association with diabetic ulcers, maggot therapy was revisited in the 1980s. Broad investigations have highlighted three mechanisms by which sterile maggots of the greenbottle fly Lucilia sericata improve healing of chronic wounds: (1) The biosurgical debridement, (2) disinfecting properties and (3) the stimulation of the wound healing process. However, the influence of maggot excretion products (MEP) on blood coagulation as part of the wound healing process has not been studied in detail. Thus, uncovering of procoagulant activities in MEP, as well as an identification of the active molecules and further characterization might offer a new perspective in modern biosurgical treatment of chronic wounds.
Therefore, in this work, the impact of MEP on coagulation of human plasma and blood was investigated by several optical and mechanical methods. The activity of contained proteases in MEP was further characterized using different chromogenic substrates, serine protease inhibitors and deficient plasmas. Furthermore total MEP content was fractionated and generated pools were analyzed for protease activity and procoagulant potential with the aim to identify active molecules in MEP and further characterize their impact on blood coagulation.
Here, we demonstrate that specific MEP-derived serine proteases from Lucilia sericata induce clotting of human plasma and whole blood, particularly by activating contact phase proteins factor XII and kininogen, providing a strong kallikrein-bypassing activity, both in plasma and isolated systems. In plasmas deficient in contact phase proteins, MEP was able to restore clotting times to normal levels. The observed kallikrein-like activity was mediated by trypsin- and chymotrypsin-like proteases in total MEP and inhibitor-studies indicated that kallikrein-like protease activity was significantly blocked by C1-esterase-inhibitor or other specific factor XIIa inhibitors. Furthermore, three major active fractions of MEP were identified. Mass spectrometry analysis of the proteins contained in these fractions and subsequent data base comparisons led to the identification of a putative candidate for MEP-mediated actions. The protein was recombinantely produced in E.coli and refolded by dialysis, before activation experiments were started with trypsin-agarose. Indeed, the Jonah protein exerts serine protease activity, which however was low when compared to total MEP. Due to the ineffective activation of the protein, in the clot-lysis assay no impact of the Jonah protein on the clotting time of human plasma was observed so far. As we showed that MEP, like kallikrein cleaved HMWK, the putative release of bradykinin and the investigation of its impact in wound healing, could offer another direction of research into the mechanisms underlying maggot therapy.
Together, MEP provides a prominent contact phase bypassing activity and thereby strongly induces blood clotting in the context of wound healing. Furthermore, an enzyme significantly involved in the procoagulant activity of MEP was identified, constituting a first step in the targeted modern biosurgical therapy of chronic wounds with isolated molecules from maggots.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand