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Lokalisation und Expression des Östrogenrezeptors alpha und Zusammenhang zwischen der mitotischen Aktivität der Spermatogonien und dem peripheren Östrogenwert im menschlichen Hoden mit normaler und gestörter Spermatogenese

Ratzenböck, Clara


Originalveröffentlichung: (2014) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.314 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-109397
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10939/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und –Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6175-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.06.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 02.07.2014
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Doktorarbeit sollten die Lokalisation und Expression des Östrogenrezeptors alpha, seine quantitative Expression im Hoden mit normaler oder gestörter Spermatogenese und ein Zusammenhang zwischen dem gemessenen peripheren Östrogenwert und der mitotischen Aktivität der Spermatogonien bei unterschiedlichen histologischen Diagnosen untersucht werden.
In der Literatur sind sehr unterschiedliche Ergebnisse über die Lokalisation des ERalpha im menschlichen Hoden zu finden. Die meisten Arbeiten beschränken sich dabei auf einen Nachweis des Rezeptors auf Protein-Ebene. Daher wurde in vorliegender Arbeit die Lokalisation auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Der Nachweis auf Proteinebene erfolgte mittels IHC und IB-Analyse, der Nachweis auf mRNA-Ebene mittels ISH und RT-PCR. Durch die Technik der UV-LAM konnten bei letzterer Methode zusätzlich einzelne Zellkompartimente isoliert gewonnen und auf die Expression des Rezeptors untersucht werden.
Die Literatur gibt auch unterschiedliche Ansätze und Theorien über den Einfluss von Östrogenen auf die männliche Fertilität wider. Daher stellte sich hier die Frage, ob beim Menschen ein Zusammenhang zwischen der mitotischen Aktivität der Spermatogonien und dem peripheren Östrogenwert besteht, und ob sich die quantitative Expression des Rezeptors mit abnehmender Qualität der Spermatogenese bis hin zu einem völligen Keimzellarrest in Form des sco signifikant verändert.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:
1) Der ERalpha war mittels zweier Antikörper (HC-20, F-10) in verschiedenen Zelltypen und auch in unterschiedlichen Zellkompartimenten nachweisbar. Die Funktionalität aller sechs Antikörper zeigte sich durch den Nachweis des Rezeptors in Kernen von Ductuli efferentes-Epithelzellen.
2) Mittels IB-Analyse unter Verwendung des F-10-Antikörpers wurden in Hodengewebe sowie MCF-7- und T47D-Zellen zwei Banden mit einem Molekulargewicht von 66 und 46 kDa nachgewiesen. Unter Verwendung des HC-20-Antikörpers konnten lediglich in MCF-7- und T47D-Zellen beide spezifische Banden nachgewiesen werden. Bei der leichteren Bande handelt es sich um eine Isoform, der die aminoterminale A/B-Domäne fehlt.
3) Mittels ISH war der Rezeptor in Spermatogonien, primären Spermatozyten sowie vereinzelt in Leydig-Zellen nachweisbar.
4) Die RT-PCR nach UV-LAM bestätigte das Vorkommen der Rezeptor-mRNA in Keimzellen.
5) Die Expression des ERalpha wurde mit abnehmender Qualität der Spermatogenese weniger.
6) Die Expression des ERbeta und des GPER waren im Hoden deutlich höher als die des ERalpha. Die Expression des ERalpha war in MCF-7-Zellen signifikant höher als im Hoden.
7) Die mitotische Aktivität war in Tubuli mit normaler Spermatogenese signifikant höher, als in Tubuli mit gestörter Spermatogenese. Es bestand kein Zusammenhang zwischen dem peripheren Östrogenwert und der mitotischen Aktivität der Spermatogonien.
Weitere Untersuchungen sollen folgendes klären:
1) spezifische Östrogen-Bindungsstellen in Hodenzellen mittels Steroid-Autoradiographie,
2) den Charakter der 46 kDa-Isoform mittels UV-LAM und RT-PCR inklusive der Sequenzierung der PCR-Produkte,
3) die genomische Sequenz des ERalpha und anderer bekannter mit Fertilität in Verbindung stehender Gene von infertilen Männern mittels genomischem ‚target enrichment’ und
4) das Expressionsmuster des ERbeta und des membranassoziierten GPER auf Protein- und mRNA-Ebene mittels IHC, IB und ISH.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this doctoral thesis was to examine the localization and expression of ERα, its quantitative expression in the testes of patients with normal or impaired spermatogenesis and whether there is a correlation between the estrogen level in peripheral blood and mitotic activity of spermatogonia in biopsies with different histological diagnoses.
In the literature, quite different results are reported regarding the localization of ERalpha in the human testis. The majority of studies, however, are restricted to the detection of the receptor at the protein level. This is why the present study investigated the localization at the protein as well as at the mRNA level. The first was determined by immunohistochemistry and immunoblot analysis, the second by in situ hybridization and RT-PCR. Using UV-LACP, it was possible to isolate individual cell compartments and to analyze the expression of the receptor in that tissue.
In the literature, there are also numerous approaches and theories on the influence of estrogens on male fertility. We thus posed the question whether there is a correlation between mitotic activity of spermatogonia and peripheral estrogen level as well as a significant change in the quantitative expression of the receptor with decreasing quality of spermatogenesis - culminating in the complete absence of germ cells (sco).
The results of the present study can be summarized as follows:
1) ERalpha was detected in different cell types and in various cell compartments using two different antibodies (HC-20, F-10). The functionality of all of the six antibodies used was shown by the detection of the receptor in the nuclei of epithelial cells of the ductuli efferentes.
2) IB analysis using the F-10 antibody showed the presence of two bands with a molecular weight of 66 and 46 kDa in testis homogenate and MCF-7 and T47D cells. Using the HC-20 antibody, the detection of the two specific bands was only possible in MCF-7 and T47D cells. The lighter band represents an isoform that lacks the amino-terminal A/B domain.
3) Using in situ hybridization, the receptor could be detected in spermatogonia, primary spermatocytes and occasionally in Leydig cells.
4) RT-PCR after UV-LACP confirmed the presence of the receptor mRNA in germ cells.
5) The expression of ERalpha decreased with decreasing quality of spermatogenesis.
6) The expression of ERbeta and of GPER in the testes was clearly higher than the expression of ERalpha. The expression of ERalpha in MCF-7 cells was significantly higher than in the testes.
7) Mitotic activity of spermatogonia was significantly higher in tubules with normal spermatogenesis than in tubules with impaired spermatogenesis. There was no correlation between peripheral estrogen level and mitotic activity of spermatogonia.
The following points need to be elucidated in further experiments:
1) specific estrogen-binding sites in testicular cells using steroid autoradiography,
2) the nature of the 46-kDa isoform using UV-LACP and RT-PCR including sequencing of PCR products,
3) the genomic sequences of ERalpha and other genes known to affect male fertility using genomic target enrichment and
4) the expression patterns of ERbeta and membrane-associated GPER at the level of protein and mRNA using IHC, immunoblot analysis and in situ hybridization.
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