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Die antivirale Therapie der chronischen Hepatitis B : Identifikation neuer Resistenzmutationen und Optimierung der Verlaufskontrolle

Antiviral therapy of chronic hepatitis B : identification of new resistance mutations and optimization of therapy monitoring

Seiz, Pia Luise


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-109371
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10937/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Medizinische Virologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.06.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 01.07.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Das Hepatitis-B-Virus (HBV) verursacht eine der häufigsten Viruserkrankungen weltweit.
Unbehandelt führt die aktive chronische Hepatitis B fast immer zu ernsten
Leberschädigungen, wie Leberfibrose oder -Zirrhose, mit fatalen Folgen, wie dem
hepatozellulären Karzinom. In dieser Arbeit wurde ein zuvor beschriebenes HBV-Isolat
(150-1) aus einem Patienten mit chronischer Hepatitis B weiter analysiert, das gegen die
Nukleotidanaloga Adefovir und Tenofovir auffällig hohe Resistenzen in vitro zeigte. Bei
diesem Isolat 150-1 konnte in dieser Arbeit in der Primerdomäne der HBV-Polymerase die
Mutation prT76S ermittelt werden, die als Sekundärmutation zusammen mit den
Primärmutationen in der Reversen Transkriptase (rtA181V und rtN236T) für die auffällig
hohe Resistenz des Klons gegen Tenofovir und Adefovir verantwortlich ist. Hierbei wurde
erstmalig eine Resistenzmutation gegen NA beschrieben, die sich in der Primer-Domäne der
viralen Polymerase und damit außerhalb der Reversen Transkriptase befindet.
Unabhängig davon wurden in zwei Studien in Zusammenarbeit mit der AG Roggendorf,
Universitätsklinikum Essen, Therapieverläufe chronisch WHV-infizierter Woodchucks als
Surrrogat-Tiermodel für die Hepatitis B des Menschen untersucht. Diese wurden in einer
ersten Studie mit Entecavir und einer DNA-(„prime-boost“)-Vakzinierung zur Stimulation von
T-Zellen gegen T-Zell-Epitope des WHsAg und WHcAg therapiert. In der zweiten Studie
wurden zusätzlich zu der Behandlung mit Entecavir und der DNA-Vakzinierung, spezifische
Antikörper gegen den Liganden (PD-L1) eines „Selbstmord“-Rezeptors (PD-1-Rezeptor) auf
T-Zellen verabreicht, die einen Verlust („Erschöpfung“) der relevanten T-Zell-Population
verhindern sollten. In dieser Arbeit wurde der Therapieerfolg, vergleichbar zur HBV-Therapie,
anhand der WHsAg-Konzentration im Blut der Woodchucks mittels Laurell-Elektrophorese
ermittelt. Die spezifische antivirale Immunreaktion bei den infizierten Woodchucks konnte
durch die oben genannten Behandlungen stimuliert werden und führte bei einigen Tieren zu
einem völligen Verschwinden des WHsAg auch nach Beendigung der Therapie. Unter
Einbeziehung weiterer klinischer Parameter kann in diesen Fällen von einer Heilung der
chronischen Hepatitis B im Tiermodell bei Woodchucks ausgegangen werden. Diesen
Untersuchungen unterstreichen die Bedeutung der HBsAg-Bestimmung für die TherapieÜberwachung
der chronischen Hepatitis. Daher wurden stabile, eukaryote Zelllinien zur
HBsAg-Produktion des WHO-Genotypen-Panels hergestellt, wodurch es nun möglich ist in
vitro rekombinantes HBsAg in nahezu unlimitierten Mengen zu exprimieren, das
nachweislich im eigenen HBsAg-Testsystem, wie auch mit einem kommerziellen
diagnostischen Test, wie dem qHBsAg-Test im System „Architect“, (Abbott), reagierte. Mit
diesem Panel können die Limitationen des WHO-Serum-Panels (limitierte Verfügbarbeit,
Infektiosität, Heterogenität von humanen Serum-Proben) verbessert werden und neu
auftretende, schlecht nachweisbare HBV-Varianten schneller integriert werden.
Kurzfassung auf Englisch: The hepatitis B virus (HBV) causes one of the most common virus diseases worldwide. An
untreated active chronic hepatitis B often leads to liver fibrosis or cirrhosis with fatal
consequences, e.g. development of hepatocellular carcinoma (HCC). The goal of this thesis
was to further analyze the previously described cloned HBV isolate 150-1 from a patient with
chronic hepatitis B that shows noticeable high resistances against the nucleotide analogues
Adefovir and Tenofovir in vitro. In this thesis it could be shown that the mutation prT76S in
the primer domain of the HBV polymerase of the isolate 150-1 works as a secondary
mutation together with the primary mutations within the reverse transcriptase (rtA181V and
rtN236T) and is responsible for the extraordinary resistance of this clone against Tenofovir
and Adefovir. Thereby for the first time a resistance mutation against NA was described that
lies in the primer domain of the viral polymerase and therefore outside the reverse
transcriptase.
Besides that, two studies were performed together with the AG Roggendorf, University
Medical Center Essen, to investigate experimental therapies in woodchucks chronically
infected with the related woodchuck hepatitis virus (WHV) as a surrogate model for human
hepatitis B. In the first study the woodchucks were treated with the NA Entecavir and a DNA-
(prime-boost) vaccination for the stimulation of T cells against T cell epitopes of the WHV
surface (WHsAg) and core (WHcAg) antigen. In the second study additionally to the
treatment with Entecavir and the DNA vaccination specific antibodies against the ligand (PDL1)
of a ´suicidal receptor (PD-1-Receptor) on T cells were given that should prevent the
exhaustion of the relevant T cell population. In this thesis, success of therapy was
determined by quantification of the surface antigen concentration in the blood, comparable to
HBV therapy using Laurell electrophoresis. Specific antiviral immune reaction in the infected
woodchucks could be stimulated by the above-named treatment with total disappearance of
the WHsAg in some animals even after stop of treatment. With the inclusion of further clinical
parameters, healing of chronic hepatitis B in the woodchuck model could be achieved, at
least in some cases.
These results underline importance of HBsAg determination for therapy control of chronic
hepatitis B. Thus, the establishment of stable eukaryotic cell lines for HBsAg expression of
the WHO HBV genotype panel allows production of recombinant SHBs in vitro in nearly
unlimited amounts, which reacted similarly in “in-house tests” and commercial quantitative
diagnostic tests for HBsAg (Abbott Architect). With this panel the limitations of the WHO
serum panel (like limited availability, infectivity, heterogeneity of human plasma samples)
could be improved and adapted to emerging HBV variants in the future.
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