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Massenspektrometrische Analyse von Anthocyanen und deren Metaboliten in komplexen biologischen Proben

Mass spectrometric analysis of anthocyanins and related metabolites in complex biological samples

Dold, Sebastian


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-109165
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10916/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Anthocyane , Massenspektrometrie
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anorganische und Analytische Chemie
Fachgebiet: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.03.2014
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 13.06.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Anthocyane stellen rote, blaue oder purpurfarbene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe dar, welchen in verschiedenen epidemiologischen Studien gesundheitsfördernde oder präventive Wirkungen aufgrund von antioxidativen Eigenschaften zugeschrieben werden. Durch die geringe Bioverfügbarkeit ist deren tatsächliche Rolle im menschlichen Organismus unklar. Um dies zu untersuchen wurde im BMBF-Verbundprojekt ANTHONIA eine umfassende Studie durchgeführt, bestehend aus einer Zellkultur-, einer Tier- und einer Humanstudie. Die daraus resultierenden komplexen Proben verlangten nach einer dezidierten Probenpräparation (Festphasenextraktion), einer robusten und dennoch schnellen Analysenmethode, die in der vorliegenden Arbeit vorgestellt wird. Eine Separation wurde durch Ultra-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (U-HPLC) erreicht. Mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) wurde diese mit einem hochauflösenden akkuraten Massenspektrometer (MS) gekoppelt. Die Identifizierung wurde durch Fragmen-tierungsexperimente des Aglykons unterstützt, da zumeist keine Standardverbindungen verfügbar waren. Mittels der verwendeten Instrumentierung ist eine Quantifizierung ohne Fragmentierungsexperiment (MS/MS) möglich. Anthocyane und direkte Metaboliten können aus Massenspektren auch retrospektiv analysiert werden, was durch „All Ion Fragmentation“ (AIF) Experimente unterstützt wird. Anthocyan-Glucoside, -Glucuronide und andere Derivate der Anthocyane konnten in über 1000 Proben quantifiziert werden. Mögliche Degradationsprodukte der Anthocyane, wie 3,4-Dihydroxybenzoesäure, können parallel analysiert werden, da die Polarität des Massenspektrometers innerhalb einer Messung kontinuierlich gewechselt werden kann. Die Massengenauigkeit im positiven Ionenmodus war generell besser als 1 ppm, daher konnte die Quantifizierung mit einem Massenfenster von delta m/z = 0,002 durchgeführt werden. Die entwickelte Methode kann für unterschiedlichste Probenmatrizes angewandt werden. In dieser Arbeit konnten Anthocyane, Metaboliten und 3,4-Dihydroxybenzoesäure in Plasma, Urin, Pflanzenextrakten, Darminhalt- und Fäzesproben analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit war essentiell, um eine korrekte Identifizierung und Quantifizierung durchzuführen.
Kurzfassung auf Englisch: Anthocyanins, red, blue and purple colorants in fruits, are widely discussed for their antioxidant properties. Their bioavailability is very low and therefore their role as health promoting substances is unclear. A comprehensive human, animal and cell culture study was designed in the framework of the BMBF project ‘ANTHONIA’ in order to study the bioavailability of anthocyanins. A dedicated sample preparation protocol and a robust and fast method was developed for diverse sample types. Separation was achieved via U-HPLC (Ultra High Pressure Liquid Chromatography) and HRMS (High Resolution Mass Spectrometry) analysis was conducted by electro-spray ionization and orbital trapping mass spectrometry. Reference substances were not available for all analytes and identification was therefore based on dedicated MS/MS experiments. High mass accuracy allowed for quantitation without the need for MS/MS experiments and consequently metabolites (e.g. products of glucuronidation) can be analyzed retrospectively supported by the ‘all ion fragmentation’ (AIF) mode. Glucuronides, glucosides and other anthocyanins could be analyzed in more than 1000 samples by this procedure. Phenolic acids such as 3,4-dihydroxy benzoic acid could be analyzed in parallel by switching polarity continuously during the measurement The developed method allows for identification by HRMS and MS/MS experiments and quantification in positive and negative ion mode by using full MS spectra. Mass accuracy in positive ion mode was better than 1 ppm, so quantification could be done by a mass window of delta m/z = 0.002. The shown method can be used for different sample types with different matrices. Plasma, urine, cell culture, extracts of intestine content and feces could be analyzed using the presented method. The developed method is not limited to the introduced application, but can be extended to raw grape extracts or other plant extracts which contain anthocyanins. High mass accuracy proved to be essential in our U-HPLC-MS measurements for the correct identification and quantification of anthocyanins and related metabolites in complex biological samples.
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