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Cyclin-dependent kinase (CDK) 6: ein molekularer Schalter zwischen dem Zellzyklus und der inflammatorischen Genregulation

Handschick, Katja


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-109023
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10902/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Zellzyklus , CDK6 , IL-1 , IL8 , Chromatin
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Rudolf-Buchheim-Institut für Pharmakologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 28.05.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Der Eintritt einer Zelle in die G1-Phase des Zellzyklus wird durch die Synthese von D-Cyclinen initiiert, die an die cyclinabhängigen Proteinkinasen CDK4 und CDK6 binden und diese aktivieren. CDK4 und CDK6 phosphorylieren in der Folge das Retinoblastom Protein Rb und aktivieren damit indirekt den Transkriptionsfaktor E2F. Dieser Arbeit vorausgehende Befunde identifizierten CDK6 darüber hinaus als eine Kinase, die in vitro die p65-Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-kappaB phosphoryliert. P65 NF-kappaB fungiert neben vielen anderen Funktionen als ein essentieller Regulator der zytokin-vermittelten inflammatorischen Genexpression. Durch kontrollierbare Überexpression einer katalytisch aktiven CDK6-Variante konnte in Zellkulturen und auf Einzelzellebene gezeigt werden, dass CDK6 die Interleukin(IL)-1-abhängige Expression des Chemokins IL-8 verstärkt. Genomweite Untersuchungen ergaben, dass der synchronisierte Eintritt von humanen epithelialen Tumorzellinien in die G1-Phase neben IL8 noch eine Reihe von weiteren proinflammatorischen Genen induzieren kann. Dieser Effekt war in Zelllinien, die eine shRNA-vermittelte Suppression von CDK6 oder CDK4 aufwiesen, stark vermindert und konnte insbesondere für CDK6 auch in nicht-synchronisierten Zellen beobachtet werden. Verschiedene Interaktionsassays, wie Kolokalisationsstudien, Koimmunopräzipitationen und proximity ligation assays (PLA) wiesen eine IL-1-regulierbare Interaktion von CDK6 mit p65 im Zellkern und in der Chromatinfraktion nach. Die Suppression von CDK6 führte zu einer Abnahme des chromatin-assoziierten p65 und einer Reduktion der Phosphorylierung an Ser536, einer Modifikation, die für den Kernimport von p65 eine Rolle spielen könnte. Darüber hinaus konnte mittels Chromatinimmunpräzipitations-Experimenten eine Korekrutierung von CDK6 und p65 an den IL8-Locus gezeigt werden. Offenbar reguliert CDK6 die Bindung von p65 an den IL8-Promotor und in der Folge die Beladung des IL8-Locus mit RNA Polymerase II. Proteomweite Untersuchungen mit phosphorylierungs-spezifischen Antikörpern gegen putative CDK6-Substrate führten zur Identifikation des Koaktivators TRIP6, dessen Interaktion mit p65 und CDK6 im Zytosol und Zellkern mittels PLA nachgewiesen wurde. Mutationen der CDK6-Phosphorylierungsstellen in TRIP6 führten zur Aufhebung der Koaktivator-Funktion von TRIP6 bei der p65-vermittelten IL8-Expression.
Neben den neuen Erkenntnissen zu CDK6-Zielgenen und zur CDK6-Chromatinassoziation beschreiben diese Ergebnisse eine bisher nicht bekannte molekulare Verbindung, über die der Zellzyklus an inflammatorische Genexpressionsprogramme gekoppelt werden kann. Die biologische Bedeutung dieser Beobachtung ergibt sich daraus, dass in vielen Tumoren der G1-CDK6-Signalweg durch Überexpression der Kinase, von D-Cyclinen oder durch verminderte Expression von Zellzyklusinhibitor-Proteinen hyperaktiviert ist. Dieses führt nicht nur zu einer unphysiologisch hohen Zellteilung des Tumors, sondern trägt entsprechend den Ergebnissen dieser Arbeit auch zu einer gesteigerten Synthese von proinflammatorischen Faktoren wie IL8 und IL6 bei. Diese können in Folge das Tumormikromilieu modulieren und so das Tumorwachstum fördern. In analoger Art und Weise könnte CDK6 durch die Amplifikation der Synthese von Entzündungsmediatoren in proliferierenden Zellen im Rahmen der Wundheilung auch in gesunden Geweben eine zusätzliche Bedeutung haben.
Kurzfassung auf Englisch: The entry of cells into the G1 phase of the cell cycle is initiated by D-cyclins which bind to and thereby activate the cyclin-dependent protein kinases CDK4 and CDK6. Subsequently, CDK4 and CDK6 phosphorylate the retinoblastoma protein Rb which indirectly leads to activation of the transcription factor E2F. Results preceding this thesis identified CDK6 additionally as a kinase which in vitro phosphorylates the p65 subunit of the transcription factor NF-kappaB. Besides multiple other functions p65 serves as an essential regulator of cytokine-mediated inflammatory gene expression. By conditional overexpression of a catalytically active variant of CDK6 we found in cell cultures as well as in single cells that CDK6 augments interleukin(IL)-1-induced expression of the chemokine IL-8. Genome-wide experiments revealed that synchronized entry of human epithelial cells into the G1 phase upregulates a variety of inflammatory genes in addition to IL8. This effect was strongly reduced in cells with shRNA-mediated suppression of CDK6 or CDK4. Particularly for CDK6 this phenomenon was also observed in unsynchronized cells. By a variety of interaction assays, such as colocalization studies, coimmunoprecipitations and proximity ligation assays (PLA) we validated an IL-1-inducible interaction of CDK6 with p65 in the nucleus and in the chromatin fraction. The suppression of CDK6 caused a reduction of association of p65 with the chromatin fraction and lowered phosphorylation at serine 536, a modification of p65 which could play a role for the nuclear import of this factor. In addition, a corecruitment of CDK6 and p65 at the IL8 locus was found by chromatin immunoprecipitation. Apparently, CDK6 regulates recruitment of p65 to the IL8 promoter and subsequently the loading of the IL8 locus with RNA polymerase II. Proteome-wide experiments using phosphorylation site specific antibodies directed against putative CDK6 substrates resulted in identification of the coactivator TRIP6 whose interaction with p65 and CDK6 in the cytoplasm and the nucleus was validated by PLA. Mutations of the CDK6 phosphorylation sites in TRIP6 abolished the coactivating function of TRIP6 in p65-mediated IL8 expression. In addition to the new findings concerning CDK6 target genes and the association of CDK6 with chromatin these results describe an up to now unknown molecular connection by which the cell cycle can be linked to inflammatory gene expression programs. The biological significance of this observation is based on the fact that in many tumors the G1-CDK6 is hyperactivated due to overexpression of the kinase, of D-cyclins or diminished expression of cell cycle inhibitor proteins. According to the results of this thesis, this not only leads to a non-physiologically high rate of cell proliferation but also contributes to the
enhanced synthesis of proinflammatory factors such as IL8 or IL6. These cytokines in turn can modulate the tumor microenvironment and thereby promote tumor growth. In an analogous fashion CDK6 might amplify the synthesis of inflammatory mediators in proliferating cells upon wound healing reactions indicating an additional role of this kinase in healthy tissues.
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