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Influence of hepatitis B virus surface protein variants associated with antiviral resistance on viral assembly and secretion of hepatitis B and hepatitis D viruses

Einfluss von Hepatitis B Virus Oberflächenproteinvarianten, die assoziiert sind mit antiviraler Resistenz, auf das virale Assembly und die Sekretion von Hepatitis B und Hepatitis D Viren

Mohr, Christina


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-108465
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10846/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): HBV , HDV , Oberflächenproteine , Assembly , Sekretion , Resistenz
Freie Schlagwörter (Englisch): HBV , HDV , surface proteins , assembly , secretion , resistance
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Medizinische Virologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.02.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 23.04.2014
Kurzfassung auf Englisch: The viral hepatitis is one of the five most important infectious diseases worldwide and is caused by the hepatitis B virus (HBV). The development of a chronic HBV infection raises the risk to generate liver fibrosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Two different therapy-concepts to treat a chronic HBV infection are used: the treatment with IFN-α and the therapy with nucleos(t)ide analogs. Due to the high variability of the HBV genome and the missing proofreading function of the viral polymerase, several drug-resistant mutants arise during the long term treatment with nucleos(t)ide analogs in chronically infected patients. Because of the strong overlapping open reading structure of the HBV genome, mutations in the viral polymerase also affect the genes of the other viral proteins especially the gene for the HBV surface proteins.
In the present work, a series of HBV surface protein variants were generated that can arise during the treatment with nucleos(t)ide analogs, bearing a stop mutation in the internal loop of the small hepatitis B surface antigen (SHBs) (sW172*, L176*, W182*, sW199*, W196*, L216*). These HBV variants show a strongly reduced secretion of HBV virions. The stop mutations in the SHBs of HBV probably lead to the loss of the internal loop between transmembrane domain III and IV resulting in a truncated SHBs variant. Surprisingly, a stop mutation at position 172 in the SHBs did not fully inhibit the secretion of HBV particles.
Mutations in the HBV surface proteins can also have strong consequences for the satellite virus of HBV: the hepatitis delta virus (HDV). This virus is dependent on the surface proteins of its helper virus HBV for virion assembly, secretion, and infectivity. The antiviral treatment with nucleos(t)ide analogs may have consequences for the clinical prognosis and treatment of a patient chronically infected with HBV as well as for HBV/HDV co-infected patients. For analyzing the implications of HBV surface protein mutations on the viral life cycle of HDV in the future, an in vitro transfection system to generate recombinant HDV pseudo-particles in the hepatoma cell line Huh7 was established. With the help of these recombinant HDV-like particles, an infection system on primary hepatocytes, derived from the asian treeshrew Tupaia belangeri was then established. In this context, a full genomic HDV RNA standard was generated in vitro to be able to quantify the newly synthesized HDV RNA absolutely. The production of HDV pseudo-particles in Huh7 cells could show that the SHBs is crucial for the viral assembly and secretion, whereas the large hepatitis B virus surface antigen (LHBs) is required for a successful infection of primary Tupaia hepatocytes. Using these methods, HDV pseudo-particles were generated, covered with HBV surface protein variants possessing characteristic mutations in the SHBs (sW172*, sW172L, sW196*, sW196S, sW196L) that can arise during antiviral therapy. The present study could show that a stop mutation at position 172 and 196 as well as an amino acid change from tryptophan to serine or leucine at position 196 in the SHBs blocks the viral assembly and secretion of HDV pseudo-particles.
Kurzfassung auf Deutsch: Die virale Hepatitis ist eine der fünf wichtigsten Infektionskrankheiten weltweit und wird verursacht durch das Hepatitis B Virus. Die Entwicklung einer chronischen HBV Infektion erhöht das Risiko, Leberfibrose, -zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom zu bilden. Zwei unterschiedliche Therapiekonzepte werden verwendet, um eine chronische HBV Infektion zu therapieren: die Behandlung mit IFN-α und die Therapie mit Nucleos(t)id Analoga. Auf Grund der hohen Variabilität des HBV Genoms und der fehlenden Korrekturlesefunktion der viralen Polymerase, entstehen während der antiviralen Langzeittherapie mit Nukleos(t)id Analoga von chronisch HBV-infizierten Patienten verschiedene Medikamenten-resistente Mutanten. Durch die stark überlappende Struktur der offenen Leserahmen des HBV Genoms, beeinträchtigen Mutationen in der viralen Polymerase auch die Gene der anderen viralen Proteine, vor allem das Gen, welches für die HBV Oberflächenproteine kodiert.
In dieser Arbeit wurden eine Reihe von HBV Oberflächenproteinvarianten generiert, die charakteristisch während einer antiviralen Behandlung mit Nukleos(t)id Analoga auftreten können, welche eine Stoppmutation in der internen Schleife des kleinen Hepatitis B Virus Oberflächenproteins (SHBs) (sW172*, L176*, W182*, sW199*, W196*, L216*) besitzen. Diese HBV Varianten weisen eine stark reduzierte Sekretion von HBV Virionen auf. Die Stoppmutationen im SHBs von HBV führen vermutlich zu einem Verlust der internen Schleife zwischen der Transmembrandomäne III und IV, was in einer trunkierten SHBs Variante resultiert. Überraschenderweise führt eine Stoppmutation an der Position 172 im SHBs nicht zur vollständigen Inhibition der Sekretion von HBV Partikeln.
Mutationen in den HBV Oberflächenproteinen können auch Konsequenzen für das Satellitenvirus von HBV haben: das Hepatitis Delta Virus (HDV). Dieses Virus ist abhängig von den Oberflächenproteinen seines Helfervirus HBV für dessen Zusammenbau, Sekretion und dessen Infektiosität. Die antivirale Therapie mit Nucleos(t)id Analoga kann Auswirkungen auf die klinische Prognose und die Behandlung von chronisch HBV-infizierten ebenso wie für HBV/HDV-koinfizierte Patienten haben. Um zukünftig die Auswirkungen von Mutationen in den HBV Oberflächenproteinen auf den viralen Lebenszyklus von HDV untersuchen zu können, wurde ein in vitro Transfektionssystem etabliert, um rekombinante HDV pseudo-Partikel in der Hepatomzelllinie Huh7 zu generieren. Mit der Hilfe dieser rekombinanten HDV ähnlichen-Partikel wurde dann ein Infektionssystem in primären Hepatozyten des asiatischen Spitzhörnchens Tupaia belangeri etabliert. In diesem Zusammenhang wurde ein voll-genomischer HDV-Standard in vitro generiert, um neu synthetisierte RNA absolut quantifizieren zu können. Die Generierung von HDV Pseudo-Partikeln in Huh7 Zellen hat gezeigt, dass das SHBs wichtig für das virale Assembly und die Sekretion ist, während das große Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (LHBs) nötig ist, um primäre Tupaia Hepatozyten erfolgreich infizieren zu können. Mit Hilfe dieser Methoden wurden HDV Pseudo-Partikel generiert, die mit HBV Oberflächenproteinvarianten umhüllt wurden, welche charakteristische Mutationen im SHBs (sW172*, sW172L, sW196*, sW196S, sW196L) aufwiesen, die während einer antiviralen Therapie auftreten können. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Stoppmutation an der Position 172 und 196, ebenso wie ein Aminosäureaustausch von Tryptophan zu Serin oder Leucin an der Stelle 196 im SHBs das virale Assembly und die Sekretion von HDV Pseudo-Partikeln inhibiert.
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