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Untersuchung des immunmodulatorischen Potentials von MCS-18 in vitro und in vivo im NOD-Mausmodell

Littmann, Leonie


Originalveröffentlichung: (2014) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.188 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-108154
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10815/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Physiologie und -Biochemie; Abt. für Immunmodulation, Hautklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6136-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 03.04.2014
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde das immunmodulatorische Potential von MCS-18 in vitro und in vivo im NOD-Mausmodell untersucht. Bei MCS-18 handelt es sich um eine natürliche Substanz, die aus dem Purpur-Nieswurz (Helleborus purpurascens) aus der Gattung der Christrosen isoliert wird.
In vitro wurde die immunmodulatorische Kapazität von MCS-18 auf murine Dendritische Zellen (DZ), isoliert aus dem Knochenmark von C57BL/6- und NOD-Mäusen, getestet. Die DZ wurden unterschiedlich stimuliert (LPS, TNF-alpha, LPS+anti-CD40) und in Ab- bzw. Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von MCS-18 (50 müg/ml, 100 müg/ml) inkubiert. Mit Hilfe von FACS-Analysen wurde die Expression von - für reife DZ typischen - Oberflächenmolekülen bestimmt. Es zeigte sich, dass es durch die Behandlung mit MCS-18 zu einer konzentrationsabhängigen Herabregulierung der Oberflächenmoleküle CD40, CD83 (C57BL/6-DZ) und CD80, CD86, CD40 sowie CD25 (NOD-DZ) kommt. Des Weiteren wurde die Funktionalität der mit MCS-18 behandelten DZ in einer gemischten Leukozyten-Reaktion (MLR) untersucht. Die stimulatorische Fähigkeit, T-Zellen zur Proliferation anzuregen, war bei den mit MCS-18 inkubierten DZ reduziert. Inwieweit MCS-18 auch eine Wirkung auf die Freisetzung der Zytokine IL-1ß, IL-6 und MCP-1 hat, wurde mit Hilfe eines CytometricBead Arrays (CBA) bzw. ELISAs analysiert. Hierbei konnte bei den mit MCS-18 inkubierten DZ für alle Zytokine eine Abnahme hinsichtlich ihrer Sekretion festgestellt werden. Außerdem wurde das Proliferationsverhalten sowie die Immunglobulin-Sekretion von B-Zellen nach der Inkubation mit MCS-18 analysiert. Interessanterweise reduzierte MCS-18 die B-Zell-Proliferation und die Immunglobulin-Sekretion der mit MCS-18 inkubierten B-Zellen.
In vivo wurde MCS-18 im non-obese diabetic-Mausmodell (NOD-Mausmodell) eingesetzt. Dieses Tiermodell dient seit über 30 Jahren der Erforschung genetischer
und pathogenetischer Grundlagen des humanen Diabetes mellitus Typ 1 (T1D). Noch immer besteht ein hoher medizinischer Bedarf an neuen Therapieansätzen, um den T1D zu verhindern bzw. zu behandeln. Aufgabe dieser Arbeit war es, die Wirkung von MCS-18 in NOD-Mäusen genauer zu untersuchen. Den NOD-Mäusen wurde MCS-18 in der 8. bzw. 8. und 12. Lebenswoche prophylaktisch intraperitoneal (i.p.) verabreicht. Ab der 10. Lebenswoche wurde einmal wöchentlich die Glukosekonzentration des Harns mittels Teststäbchen bestimmt. Bei diesem Vorgehen konnte gezeigt werden, dass MCS-18 in der Lage ist, das diabetesfreie Überleben im NOD-Mausmodell zu erhöhen. In der Tiergruppe, die mit MCS-18 während der 8. und 12. Lebenswoche behandelt wurde, zeigten 70% der Tiere ein diabetesfreies Überleben bis in die 30. Woche, während im Gegensatz dazu unter den unbehandelten Tieren weniger als 10% diabetesfrei blieben. Die Pankreata der diabetesfreien MCS-18 behandelten NOD-Mäuse sowie der unbehandelten Kontrolltiere wurden mRNA-Analysen unterzogen. Im Gegensatz zu den unbehandelten Kontrolltieren konnte bei den MCS-18 behandelten Mäusen eine signifikante Erhöhung der mRNA Expression für Insulin 1, Insulin 2, sowie den Transkriptionsfaktor Foxp3 nachgewiesen werden. Für die IFN-gamma mRNA Expression zeigte sich eine signifikannte Reduktion bei den MCS-18 behandelten Mäusen im Vergleich zu den diabetischen Kontrolltieren. Zudem konnten durch FACS-Analysen in den Pankreata der MCS-18 behandelten Tiere signifikant mehr Foxp3+ T-Zellen nachgewiesen werden als bei den unbehandelten Kontrolltieren. In den Milzen und Pankreatischen Lymphknoten konnte keine Veränderung in der Population der Foxp3+ T-Zellen nachgewiesen werden. Um eine Aussage über den morphologischen Zustand der Langerhans´schen Inseln zu bekommen, wurden die Pankreata der Mäuse immunhistologisch untersucht. Bei den MCS-18 behandelten NOD-Mäusen sowie unbehandelten Kontrollmäusen konnte eine Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen beobachtet werden. Gleichzeitig konnten in den Langerhans’schen Inseln der MCS-18 behandelten NOD-Mäuse aber auch vermehrt Foxp3+ T-Zellen nachgewiesen werden. Abschließend wurden isolierte Milzzellen auf ihre Peptid-spezifische, IFN-gamma produzierende Fähigkeit mittels Elispot-Assay untersucht. Durch die Peptide Insulin und NRP-A7 wurden die isolierten Milzzellen stimuliert. Die durch NRP-A7 hervorgerufene T-Zell-Aktivierung und damit verbundenen IFN-gamma Sekretion war bei den Zellen aus den MCS-18 behandelten Mäusen, im Vergleich zu jenen aus den Kontrollltieren, signifikant reduziert.
Kurzfassung auf Englisch: In the present study the immune-modulatory potential of MCS-18 was examined in vitro and in vivo using the NOD-mouse model. MCS-18 is a natural product isolated from Helleborus purpurascens (i.e. Christmas rose).
The immune-modulatory capacity of MCS-18 was tested on murine BM-DC of C57BL/6- and NOD-mice in vitro. The DC were cultured with different stimuli (LPS, TNF-alpha, LPS+anti-CD40) and incubated in the presence of different concentrations of MCS-18 (50 or 100 my g/ml) or were left untreated (mock). FACS analyses were performed to measure the expression of functionally important surface molecules typical for the matured DC such as CD40, CD83, CD80, CD86 or CD25. Interestingly, MCS-18 inhibited the expression of DC-specific molecules and lead to an impaired T-cell stimulation capacity. Furthermore, NOD-DC cultured in the presence of MCS-18 showed a clear reduction in their expression of IL-1ß and IL-6 as well as MCP-1. In addition, MCS-18 also reduced B-cell proliferation and immunoglobulin production.
In vivo MCS-18 was tested in NOD mice, a model for type 1 diabetes. There is still a need for new therapies in order to prevent or treat type I diabetes. In the context of this doctoral thesis it can be shown that MCS-18 is able to increase diabetes free survival using the NOD-mouse model. In those animals that have been treated with MCS-18 at the age of 8 and 12 weeks 70% showed a diabetes free survival at week 30. In contrast, in untreated animals less than 10% were free of diabetes. As one possible mechanism for the protective function of MCS-18 in this animal model, the percentage of regulatory T cells present in spleen, pancreatic lymph node and pancreas was analysed by FACS. In pancreas of MCS-18 treated, animals, the CD25+Foxp3+ cell population was significantly enhanced in comparison to mock treated diabetic animals, whereas the ratio of CD25+Foxp3+ cells in spleen and pancreatic lymph node was comparable to MCS-18 treated and mock animals. Toconfirm these findings, real-time PCR analyses of the pancreata were performed. For this, mRNA copy numbers specific for insulin 1, insulin 2, IFN-gamma and Foxp3-mRNA were determined. Statistically significant higher levels of insulin 1 and insulin 2 and Foxp3 specific transcripts were detected in MCS-18 treated animals in comparison to mock treated animals. In contrast, IFN-gamma levels were decreased in the MCS-18 treatment group. In order to further support these findings, serial sections of pancreatic tissue from MCS-18 treated animals and mock treated animals were stained with antibodies specific for CD4, CD8 und Foxp3. MCS-18 treated animals were examined at the age 30 weeks. Mock treated control mice with a diagnosed glucosuria showed a strong infiltration of CD4+ and CD8+ T cells. Moreover, Foxp3+ T cells were rare. Although MCS-18 treated animals had a marked periinsulitis, CD4+ as well as CD8+ T cells were present. These animals manifested a strongly preserved insulin expression in comparison to mock treated animals. Furthermore, MCS-18 treated animals showed an increased number of Foxp3+ cells indicating the presence of regulatory T-cells. The influence of MCS-18 treatment on the Th1-response associated cytokine secretion (i.e. IFN-gamma) after stimulation with type 1 diabetes auto-antigens (insulin B chain and NRP-A7) was investigated using ELISPOT assays. Mock treated animals showed a strong IFN-gamma secretion in response to the auto-antigen insulin and even more to NRP-A7. In contrast, MCS-18 treatment showed a trend towards a reduction in IFN-gamma secretion upon stimulation with insulin 1 and even stronger after the stimulation with NRP-A7. These findings suggest a suppressive effect on cytotoxic Th-1 cells, e.g. diabetogenic CD8+ T cells, in MCS-18 treated animals.
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