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Generierung hochspezifischer Nukleasen für die zielgerichtete Spaltung genomischer DNA-Sequenzen

Yanik, Mert


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-105814
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10581/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): hochspezifische Nuklease , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Englisch): highly specific nucleases
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 21.01.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Hochspezifische Nukleasen haben sich im Bereich gene targeting und gene therapy zu unentbehrlichen Werkzeugen entwickelt. Eine auf Zufall basierte Integration von DNA-Sequenzen ins Genom verschiedener Organismen mit den damit verbundenen Nebenwirkungen kann mit Hilfe dieser Werkzeuge vermieden werden. Die Möglichkeit, ein Gen im Genom an einer definierten Position zu reparieren, ein- oder auszuschalten oder zu ersetzen, besitzt neben der therapeutischen Anwendung auch enormes Potential in der Grundlagen- wie auch in der angewandten Forschung. Die einzelnen Funktionen von Genen und deren Wechselwirkungen in einem Modellorganismus lassen sich damit sehr gut studieren. Damit vereinfacht sich auch die Züchtung von Pflanzen und Tieren.
Die Basis der gängigsten Nuklease-Architekturen bildet das unspezifische Spaltmodul FokI, welches in Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) am häufigsten verwendet worden ist. Mit sogenannten TAL-Effektoren ist es gelungen, in einer vergleichsweise unkomplizierten Art und Weise spezifische Nukleasen, die sogenannten TALEN, zu generieren. Beide Architekturen lassen sich programmieren, neigen aber durch den FokI-DNA-Spalt-Mechanismus zu unerwünschten Reaktionen. In dieser Arbeit werden zwei alternative Spaltmodule zu FokI mit vielversprechenden Resultaten präsentiert. Die allosterische Aktivierung des BfiI-Restriktionsenzyms und die Charakterisierung der TALE-PvuII-Konstrukte.
Mit BfiI-Varianten konnte die Bindung an die Wildtyp-BfiI-Erkennungssequenz unterbunden und ein Einzelstrangbruch mit Hilfe von in cis gebundenen Bindungsmodulen durchgeführt werden. Die Toxizität des BfiI-Fusionsenzyms ist extrem vermindert, da eine katalytische Aktivität nur durch die langen Erkennungssequenzen der Bindungsmodule dirigiert wird. Weitere Untersuchungen hinsichtlich heterodimerer Varianten werden genauere Aussagen über ihren Nutzen treffen können.
Das TALE-PvuII-Fusionskonstrukt spaltet nur adressierte TALE-PvuII-Erkennungssequenzen und zeigt keine Aktivität gegenüber isolierten PvuII-Sequenzen, trotz Enzymüberschusses und langen Inkubationszeiten. Die in vitro-Spaltungskinetiken zeigten, dass die Präferenz für eine adressierte Sequenz gegenüber einer nicht-adressierten Sequenz bei einem Faktor > 34.000 liegt. Darüber hinaus sind die TALE-PvuII-Konstrukte in HEK293-Zellen aktiv und weisen nur eine minimale Zytotoxizität auf. Zusammen mit den vielversprechenden heterodimeren TALE-PvuII-Varianten bleibt ihre Effektivität auf die Anwendung chromosomaler Sequenzen abzuwarten.
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