Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Untersuchungen der Blut-Hoden-Schranke während der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation mittels eines slow release GnRH-Implantates beim Rüden : Expression von Connexin 43, Occludin, Claudin-3, -5 und -11

Röhrs, Lena


Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.659 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-105682
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/10568/

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us


Freie Schlagwörter (Deutsch): Blut-Hoden-Schranke , Rekrudeszenz , GnRH-Implantat , Sertoli-Zelle , Spermatogenese
Freie Schlagwörter (Englisch): Gap junction , tight junction , blood-testis-barriere , recrudescence , downregulation
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- u. Kleintiere mit Tierärtzlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 13.01.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Die Integrität der Blut-Hoden-Schranke (BTB), als wichtiger Faktor für den
reibungslosen Ablauf der Spermatogenese, ist in der Literatur bereits eindeutig
beschrieben. Dabei teilt die BTB das Keimepithel der Tubuli seminiferi in ein basales
und ein adluminales Kompartiment und gewährleistet damit den Schutz der primären
Spermatozyten und haploiden Spermatiden vor potenziell schädlichen Substanzen
durch eine Passagebehinderung von Molekülen aus dem Interstitium in das
adluminale Kompartiment. Einen maßgeblichen Anteil am Aufbau der BTB haben
Tight- und Gap-Junctions, welche wiederum aus verschiedenen integralen
Membranproteinen lokalisiert zwischen benachbarten Sertoli-Zellen aufgebaut sind.
Wie bereits in verschiedenen Spezies nachgewiesen sind besonders das Gap-
Junction Protein Connexin (Cx) 43 sowie die Tight-Junction Proteine Occludin
(OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 und -11 an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion
beteiligt.
Ziel dieser Arbeit war es, die Entwicklung der BTB im Verlauf der Rekrudeszenz der
Spermatogenese durch die Untersuchungen von Cx43, OCLN, CLDN-3, -5, und -11
auf mRNA-Ebene sowie Cx43 ebenfalls auf Protein-Ebene zu charakterisieren.
Hierbei wurde das Modell der Downregulation mittels eines slow release GnRHImplantates
genutzt, um einen Arrest der Spermatogenese auf Ebene der
Spermatogonien bzw. Spermatozyten zu induzieren. Die gewonnenen Daten sollten
mit der Situation am juvenilen bzw. am adulten, unbehandelten Hoden verglichen
werden.
23 Beagle-Rüden wurden mit einem slow release GnRH-Implant (Gonazon ®, 18,5
mg Azagly-Nafarelin) behandelt, welches nach 5 Monaten nach Downregulation der
endokrinen und germinativen Hodenfunktion entfernt wurde. Jeweils 3-4 Rüden
wurden im Intervall von 3 Wochen (Wo0-24) chirurgisch kastriert. Die Einteilung der
Hunde erfolgte zum einen nach dem Zeitpunkt der Kastration (Wo-0, -3, -6, -9, -12
und 24) und zum anderen nach histologischen Charakteristika, d.h. den am
weitesten entwickelten Keimzellen („developental groups“: DG A (Spermatozyten),
DG B (runde Spermatiden), DG C (elongierende Spermatiden) und DG D (elongierte
Spermatiden)). Um den Effekt unterschiedlicher GnRH-Agonist Implantate zu
untersuchen, wurden konform mit Woche 0 zudem je 3 Hunde mit Suprelorin®, (4,7
mg Deslorelin) bzw. Profact® Depot (6,3 mg Buserelinacetat) behandelt und
ebenfalls nach 5 Monaten während des Status der Downregulation chirurgisch
kastriert. Als Kontrollgruppen diente das Hodengewebe von 5 adulten und 3 juvenilen
Rüden.
Auf mRNA-Ebene gelang der Nachweis der Expression für die 5 untersuchten Gene
(Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) in allen untersuchten Gruppen mittels RT-PCR
und qPCR. Sowohl Cx43 als auch CLDN-11 zeigten in der Wochengruppe (Wo) 3
signifikant höhere Werte als in der Wo12, sowie Cx43 ebenso zu Wo24. Für OCLN
zeigten sich sowohl im Wochengruppenvergleich eine signifikant geringere
Expression in Wo0 und Wo3 verglichen mit Wo6, als auch im DG-Vergleich für DG A
verglichen mit DG C, DG D und CG sowie für DG B im Vergleich zu DG D. CLDN-3
und -5 zeigten im Wochengruppenvergleich die stärkste Genexpression in Wo0, was
sich für CLDN-5 ebenfalls im DG-Vergleich bestätigen ließ.
Für Cx43 erfolgte zusätzlich der Nachweis auf Proteinebene, wobei die
Immunhistochemie eine spezifische Färbung zwischen Sertoli-Zellen und zwischen
Sertoli-Zellen und basal gelegenen Keimzellen ergab. Im Verlauf der Rekrudeszenz
der Spermatogenese kam es zu einer Verlagerung des Signals aus dem adluminalen
in das basale Kompartiment. In DG C und DG D sowie in den Wo6, -9, -12 und -24
zeigte sich wie in CG ein charakteristisches immunhistochemisches Bild mit einer
immunopositiven Reaktion zirkulär oberhalb der Spermatogonien und unterhalb der
primäre Spermatozyten.
Die Expression der untersuchten Proteine weist sowohl auf mRNA als auch auf
Protein-Ebene auf eine Veränderung bzw. einen Zerfall der BTB im Verlauf der
Downregulation hin. In Bezug auf die gewonnenen Ergebnisse scheint eine schnelle
Wiederherstellung der BTB gegeben und es zeigt sich nach vollständiger
Rekrudeszenz der Spermatogenese (Wo12, -24) für alle Proteine auf mRNA- und für
Cx43 auch auf Proteinebene kein signifikanter Unterschied zu den unbehandelten
Kontrollgruppen.
Die gewonnenen Ergebnisse weisen eindeutig auf die Funktion von Cx43, OCLN,
CLDN-3, -5 und -11 für die BTB beim Hund hin. Während sich durch die
Downregulation signifikante Veränderungen der Proteine im Bereich der BTB
ergeben, belegen die vorliegenden Daten, dass nach erfolgter Rekrudeszenz der
Ausgangszustand der ungestörten Spermatogenese mit intakter BTB
wiederhergestellt wird, sodass die durch die Anwendung eines slow release GnRHAgonist-
Implantates induzierten Effekte nicht nur auf Ebene der Steroidogenese und
anhand der morphologischen Charakteristika, sondern auch auf Ebene der BTB als
vollständig reversibel angesehen werden können
Kurzfassung auf Englisch: The integrity of the blood-testis-barrier (BTB) as a major factor for spermatogenesis
has already been adressed in literature. The BTB separates the germinal epithelium
into a basal and an adluminal compartment and protects primary spermatocytes and
haploid spermatids against potentially hazardous substances by inhibiting
transportation of certain molecules from the interstitium into the adluminal
compartment. Tight- and Gap-Junctions consisting of various integral membrane
proteins between adjacent sertoli cells are the major component of the BTB. The
Gap-Junction protein Connexin (Cx) 43 as well as the Tight-Junction proteins
Occludin (OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 and -11 are predominantly involved in the
barrier function.
Aim of the present study was to characterise the mRNA.expression of Cx43, OCLN,
CLDN-3, -5, and -11 and protein expression of Cx43 on the development of the BTB
during recrudescence of spermatogenesis. The model of the downregulated testis
was used to induce an arrest of spermatogenesis on the level of spermatogonia and
primary spermatocytes. The results obtained should be compared with the juvenile
and the adult canine testis.
23 male Beagle were treated with a slow release GnRH-implant (Gonazon®, 18.5 mg
Azagly-Nafarelin) which was removed after five months following downregulation of
the endocrine and germinative testicular function. Three to four dogs each were
castrated at 3-week intervals (week 0-24). Grouping of dogs was according to the
time of castration (week 0, 3, 6, 9, 12 and 24), but also according to histological
criteria (the most developed germ cell observed) (developmental groups: DG A,
spermatocytes; DG B, round spermatids; DG C, elongating spermatids and DG D,
elongated spermatids). To test for the influence of the GnRH-agonist implant 3 dogs
each were treated with a Suprelorin® (4.7 mg Deslorelin) or Profact® Depot (6.3 mg
busereline acetate) implant and castrated after 5 months during downregulation. Five
adult and 3 juvenile male dogs served as controls.
The 5 investigated genes (Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) were proven in all
groups using RT-PCR and RT-qPCR. mRNA expression of Cx43 and CLDN-11 was
significantly higher in week (w) 3 compared to w12 and w24 (the latter Cx43 only).
OCLN expression was significantly lower in w0 and -3 compared to w6; besides it
was lower in DG A compared to DG C, DG D and CG as well as for DG B compared
to DG D. For CLDN-3 and -5, gene expression was highest in w0 and DG A (CLDN-
5).
Cx 43 was also investigated on the protein level with a specific staining being
observed in immunohistochemistry between sertoli cells and sertoli cells and basal
germ cells. During recrudescence of spermatogenesis, the immunopositive signal
was relocated from the adluminal to the basal compartment. In DG C and -D, w6, -9,
-12 and -24 as well as CG the characteristic staining pattern with a staining circular
above the spermatogonia and below the primary spermatocytes was detected.
Western Blot was used to verify specificity of the antibody.
The expression of the investigated genes on the mRNA and protein level points to a
disintegration of the BTB during downregulation. Reorganisation of the BTB occurs
rapidly with no significant difference being detected following recrudescence (w12,
w24) compared to the untreated adult controls. The results obtained underline the
function of Cx 43, OCLN, CLDN-3, 5 and 11 for the BTB in the dog. Significant
changes occur during downregulation. Following recrudescence, spermatogenesis
including the BTB recovered completely leading to the conclusion that the effects
induced by treatment with a slow release GnRH-agonist implant are fully reversible –
not only regarding steroidogenesis and morphological characteristics as shown
before- but also regarding the BTB.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand