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Spatial-temporal modelling of liver damage as well as regeneration and its influence on metabolic liver function

Zeitlich-räumliche Modellierung von Leberschädigung und Regeneration unter Berücksichtigung des Lebermetabolismus

Ghallab, Ahmed Mohammed


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-98761
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2013/9876/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie; TU Dortmund, Leibniz-Institut für Arbeitsforschung (IfADo)
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.04.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 17.07.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Die Leber spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung des metabolischen Gleichgewichts. Akutes Leberversagen ist daher lebensbedrohlich. Relativ wenig ist bekannt, wie metabolische Funktionen während und nach Leberschädigung aufrechterhalten werden. Die Ziele dieser Arbeit waren daher 1) metabolische Veränderungen der Leber der Maus während Leberschädigung- und Regeneration zu untersuchen, 2) die Ammoniak-Entgiftung zu modellieren, 3) die Veränderungen der metabolischen Zonierung des Leberläppchens während Leberschädigung und Regeneration zu berücksichtigen, 4) mögliche Kompensationsmechanismen während der Schädigungs- und Regenerationsphase zu identifizieren. Für diese Untersuchungen wurden Mäuse eingesetzt, denen Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) zur Verursachung eines akuten Leberschadens injiziert wurde. Für den Ammoniakstoffwechsel relevante Parameter wurden Zeit- und Dosisabhängig nach Injektion von CCl4 erfasst: Ammoniak, Harnstoff, Glutamin, Glutamat, Glucose, Laktat, Pyruvat, Alanin, und alpha-Ketoglutarat. Diese Analysen wurden durchgeführt in Blut aus a) der Portalvene, welche den „Lebereingang“ repräsentiert, b) der Lebervene als „Leberausfluss“ und c) der rechten Herzkammer, um auch gemischt venöses Blut zu erfassen.
Um die komplexen Vorgänge des Ammoniakstoffwechsels quantitativ erfassen zu können, wurde ein metabolisches Modell eingesetzt. Vorhersagen dieses metabolischen Modells (welches alle zur Zeit wesentlichen Prozesse des Ammoniakstoffwechsels einschließt) wurden mit den experimentellen Daten verglichen. Nach mehreren Zyklen von Experimenten und Modellierung wurde hierbei gezeigt, dass die bisher bekannten Mechanismen nicht ausreichen, den Ammoniakstoffwechsel während Leberschädigung quantitativ zu beschreiben. Vielmehr wurde der folgende Mechanismus identifiziert, welcher für das Verständnis der gesamten Situation wesentlich ist: nach Leberschädigung setzen geschädigte Hepatozyten neben zahlreichen weiteren Proteinen Glutamatdehydrogenase (GDH) in dem systemischen Blutkreislauf frei. Sobald die Ammoniakkonzentrationen im Blut ansteigen, findet eine GDH-Reaktion in umgekehrter Richtung statt. Bei dieser Reaktion wird der toxische Ammoniak dadurch entgiftet, dass er mit Ammoniak zum relativ untoxischen Glutamat verbunden wird. Ein neuer Aspekt ist hierbei, dass Ammoniakentgiftung in Folge der GDH-Freisetzung nicht nur in der Leber, sondern auch systemisch im Blut stattfindet. Allerdings kann diese entgiftende Reaktion im Blut nur so lange stattfinden, bis das dort vorhandene alpha-Ketoglutarat durch die GDH-Reaktion verbraucht wurde. Diese Beobachtung ist möglicherweise von klinischer Relevanz. Denn sobald die alpha-Ketoglutarat Konzentration in der Leber als Folge der GDH-Reaktion absinkt, könnte es therapeutisch substituiert werden. Dieser Mechanismus der reversen GDH-Reaktion wurde bei Experimenten mit Plasma von Mäuse und mit kultivierten Hepatozyten der Maus beobachtet. Nach Verabreichung von CCl4 an Mäusen wurde eine transiente Zunahme von GDH im Plasma beobachtet. Dies ging einher mit einer sehr starken Abnahme des alpha-Ketoglutarat. Falls Plasma in diesem Zustand Mäusen entnommen wurde, konnte Ammoniak-Entgiftung zu Glutatmat nur dann beobachtet werden, nachdem alpha-Ketoglutarat zugesetzt worden war. Weiterhin konnten im Plasma sowohl die Ammoniakentgiftung, als auch die Bildung von Glutamat durch den GDH-Inhibitor 2,6 Pyridine dicarboxylsäure (PDAC) gehemmt werden. In kultivierten Hepatozyten steigerte PDAC die Toxizität des Ammoniaks. Bemerkenswert ist, dass kultivierte Hepatozyten nur bei hohen Ammoniakkonzentrationen im Kulturmedium Ammoniak zu Glutamat entgifteten. Bei niedrigen Konzentrationen gaben Hepatozyten sogar noch Ammoniak in das Kulturmedium ab. Auch diese Beobachtung passt zur Hypothese des „GDH switch“, wobei GDH bei niedrigen Ammoniakkonzentrationen Ammoniak produziert, hingegen bei hohen Konzentrationen konsumiert.
Leberschädigung mit CCl4 verursachte eine transiente Störung der metabolischen Zonierung des Läppchens. Zum Beispiel wurde eine verzögerte Erholung des perizentralen Markers Glutaminsynthetase beobachtet. Im Gegensatz hierzu dehnte das normalerweise auf die periportale Region begrenzte Enzym Carbamoylphosphat-Synthetase sein Territorium auf das gesamte Leberläppchen aus. Dies wurde zwischen Tag 4 und 6 nach Intoxikation mit CCl4 beobachtet. Nachdem sämtliche neue Mechanismen im Modell berücksichtigt wurden, ergab sich eine gute Übereinstimmung zwischen der Modellsimulation und den experimentellen Daten.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Leber nach akuter Schädigung einen systemischen Schutz gegen Hyperammonämie durch Freisetzung von GDH vermittelt. Eine mögliche klinische Relevanz dieser Beobachtung besteht darin, dass alpha-Ketoglutarat im Plasma therapeutisch substituiert werden könnte, sobald es durch die GDH Reaktion verbraucht worden ist.
Kurzfassung auf Englisch: The liver is responsible for maintaining the metabolic homeostasis throughout the body. Therefore, acute liver failure is life threatening. Only little is known about how the complex metabolic function of the liver is restored after liver injury. The goals of this thesis were to 1) study the metabolic alterations during liver damage and regeneration, 2) model ammonia detoxification during liver damage and regeneration, 3) study the alterations of metabolic zonation and to 4) identify possible compensatory mechanisms for ammonia detoxification during liver damage and regeneration. For this purpose I used a mouse system where the hepatotoxic agent CCl4 was injected to induce acute liver damage. Metabolic parameters relevant for ammonia and carbohydrate metabolism were quantified in a time and in a dose-dependent manner after CCl4 intoxication including ammonia, urea, glutamine, glutamate, glucose, lactate, pyruvate, alanine, arginine and alpha-ketoglutarate. The measurement was done in blood collected from the portal vein “representing the liver inflow”, the hepatic vein “representing the liver outflow” and from the heart “representing the mixed venous blood”.
For deeper understanding of ammonia metabolism during liver damage and regeneration, a model of ammonia detoxification was established. Model predictions and experimental data were compared. After iterative cycles of modeling and experiments the following so far unknown mechanism was identified. Upon acute liver damage hepatocytes release glutamate dehydrogenase (GDH) (together with further liver enzymes) into the systemic circulation. As soon as blood ammonia concentrations increase, the GDH reaction takes place in a reversed manner. This means that GDH uses ammonia and alpha-ketoglutarate (A-KG) as substrates to form glutamate. By this reaction the toxic ammonia is detoxified to form the non-toxic glutamate. Interestingly, this reaction is not limited to the liver itself but upon release of GDH from damaged hepatocytes protection against ammonia is provided systemically in blood. However, this protection lasts only as long as A-KG is present in the blood. It can not continue when A-KG has been consumed by the GDH reaction. This observation is of clinical relevance since it might be possible to therapeutically substitute α-KG after induction of acute liver damage. This mechanism was discovered in experiments with plasma of mice and in vitro with cultivated hepatocytes. After administration of CCl4 a transient increase of plasma GDH was observed which was accompanied by a decrease in A-KG. When plasma was taken from such mice detoxification of ammonia to glutamate was only observed when A-KG was added. Ammonia detoxification as well as glutamate production were both blocked by addition of the GDH inhibitor 2,6-pyridinedicarboxylic acid (PDAC). In cultivated hepatocytes PDAC increased ammonia cytotoxicity. Interestingly, hepatocytes decreased the ammonia concentrations in the culture medium at high ammonia concentrations. In contrast, hepatocytes released ammonia if its concentrations in the culture medium were relatively low. This fits to the mechanism that GDH switches from ammonia production to ammonia detoxification if the concentrations of ammonia increase.
Studying the metabolic zonation after CCl4 intoxication showed a transient disturbance of metabolic zonation during liver regeneration. This included the delayed recovery of the pericentral marker glutamine synthetase. In contrast, the territory of the periportal marker carbamoyl phosphate synthetase1 is extended to cover the whole liver parenchyma on days four and six after CCl4 intoxication. When these findings were included into the model, the predictions of both ammonia and glutamine were in a good accordance with the experimentally obtained data.
In conclusion, the acutely damaged liver provides systemic protection against hyperammonemia by the release of GDH into the blood. As soon as plasma A-KG is consumed by the GDH reaction it should be therapeutically substituted.
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