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Der Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT : Gewebeexpression, vergleichende funktionelle Charakterisierung und Generierung einer 3D-QSAR Pharmakophore

Grosser, Gary


Originalveröffentlichung: (2013) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (8.958 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-92018
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2013/9201/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5990-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.01.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 14.02.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Die physiologische Rolle des humanen SOAT (SLC10A6), welcher sulfatierte Steroidhormone wie DHEAS, E1S und PREGS transportiert und im Hoden stark exprimiert wird, ist derzeit noch unklar. Zur Aufklärung ist daher die Generierung einer Knockout-Maus angedacht, weshalb der Soat der Maus (mSoat) kloniert und funktionell charakterisiert wurde, um eine Übertragbarkeit der erhaltenen Ergebnisse auf den Mensch zu gewährleisten. Die Resultate der quantitativen RT-PCR zeigten eine sehr hohe mSoat-Expression in der Lunge und eine hohe Expression in Hoden und Haut. Immunhistochemische Untersuchungen führten zu einer spezifischen Anfärbung der Bronchialepithelzellen in der Lunge, der pachytänen primären Spermatozyten im Hoden, der Epidermis der Haut und dem Urothel der Blase. Aufnahmeversuche an stabil transfizierten mSoat-HEK293-Zellen zeigten dasselbe Substratspekt-rum des humanen SOAT; die Bestimmung der Michaelis-Menten Kinetiken ließ jedoch eine deutliche Präferenz des mSoat zum PREGS als Substrat erkennen. Zusammengefasst kann der Soat der Maus, trotz Unterschieden in der Genexpression und den Transportaffinitäten, als homologer Transporter des humanen SOAT angesehen werden.
Durch eine RACE-PCR wurde die Soat-Sequenz vom Schwein bestimmt (susSoat). Ein Aminosäurevergleich weist eine höhere Sequenzidentität des humanen SOAT zum susSoat (82,2 %) als zum mSoat (71 %) auf. Durch quantitative RT-PCR konnte eine 465-fache Erhöhung der susSoat-Expression im Hoden eines 250 Tage alten geschlechtsreifen Schweins gegenüber dem Hoden eines präpubertären 50 Tage alten Schweins festgestellt werden. In Verbindung mit der dargestellten Proteinexpression in pachytänen primären Spermatozyten bei der Maus spricht dies für eine Rolle von SOAT im Hoden ab der Pubertät.
Zwei weitere wichtige Mitglieder der SLC10-Famile, zu der auch SOAT zählt, weisen eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislauf der Gallensäuren zwischen Leber und Dünndarm auf, der ASBT und der NTCP. Trotz der hohen phylogenetischen Verwandtschaft zum SOAT zeigen sich deutliche Unterschiede in der Substratspezifität. Während NTCP sowohl sulfatierte Steroidhormone als auch Gallensäuren und glukuronidiertes Estron transportiert, erkennt ASBT nur Gallensäuren als Substrat, SOAT dagegen nur sulfatierte Steroidhormone. Erstmals konnte jedoch ein Substrat für alle drei Transporter entdeckt werden, das Taurolithocholat (TLC); demnach müssen bei der Substraterkennung die Bindungsstellen Gemeinsamkeiten aufweisen. Sowohl DHEAS als auch TLC wurden vom SOAT als Substrat erkannt; eine Erklärung hierfür wäre, dass bei einer Überlagerung der beiden Substrate die räumlichen Strukturen der Sulfat- bzw. Sulfongruppe annähernd passend übereinander gelegt werden können. Lithocholat, unkonjugierte Steroide und glukuronidiertes Estradiol wurden von keinem der drei Transporter aufgenommen.
Zur Generierung eines SOAT-Pharmakophormodells wurden mehr als 100 Substanzen auf ihre Inhibition der DHEAS-Aufnahme in SOAT-HEK293-Zellen überprüft. Die 3D-QSAR SO-AT-Pharmakophore, berechnet durch den Catalyst Algorithmus, besteht aus fünf charakteristischen Bereichen. Taurolithocholat-3-sulfat, ein potenter Inhibitor des SOAT-Transports, erfüllt alle fünf dieser Kriterien: a) drei hydrophobe Bereiche, eine am A-Ring und zwei an den Methylgruppen an Position 18 und 21 des Gallensäuregerüsts; b) die Sulfatgruppe an Position 3 und die Sulfongruppe des Taurins fungieren als Wasserstoffbrückenakzeptoren. Zu den bereits existierenden Pharmakophormodellen des ASBT und NTCP konnten so Gemeinsamkeiten, aber auch spezifische Unterschiede festgestellt werden.
Ingesamt achtzehn Substanzen, darunter Testosteron und Progesteron, führten zu einer konzentrationsabhängigen Stimulierung des SOAT-Transports von DHEAS. Eine physiologische Rolle der Stimulation ist möglich, da z.B. reichlich Testosteron im Hoden produziert wird und eine hohe Expression von SOAT im Hoden demonstriert wurde. So könnte mit Beginn der Pubertät eine Stimulation der DHEAS-Aufnahme durch Testosteron zu einer erhöhten Bereitstellung von DHEAS in der Zelle führen. Durch eine erhöhte Synthese von Testosteron aus DHEAS könnte auf diese Weise ein stimulierender Kreislauf entstehen.
Kurzfassung auf Englisch: The physiological role of the human SOAT (SLC10A6), which is highly expressed in testis and transports sulfoconjugated steroid hormones is not well understood yet. Therefore, a knockout mouse model was considered that may elucidate the biological significance of this process for reproduction and other hormone dependent processes. However, a prerequisite for this purpose is the cloning of Soat from the mouse (mSoat) and its thorough expression analysis and functional characterization in order to assess the transferability of the results to the situation in humans. Quantitative mRNA expression analysis for mSoat revealed very high expression in lung and further high expression in testis and skin. Immunohistochemical studies showed expression of the mSoat protein in bronchial epithelial cells of the lung, in pachytene primary spermatocytes within the seminiferous tubules of the testis, in the epi-dermis of the skin as well as in the urinary epithelium of the bladder. Stably transfected mSoat-HEK293 cells revealed sodium-dependent transport for the same substrates as the human SOAT, but determination of Michaelis-Menten kinetics demonstrated a preference to PREGS as substrate for mSoat. In conclusion, some differences between SOAT and mSoat exist in the quantitative gene expression in endocrine and non-endocrine tissues as well as in the transport kinetics for steroid sulfates, but in general mSoat can be regarded as homo-logous carrier for SOAT.
Additionally, the Soat mRNA sequence of the pig (susSoat) was determined via RACE-PCR. A comparison of the amino acid sequences showed a higher identity of human SOAT to susSoat (82.2%) than to mSoat (71%). Quantitative mRNA expression analysis revealed a 465-fold increase of susSoat in the testis of a 250 days old sexually mature boar compared to a 50 days old preadolescent male pig. Associated with the demonstrated mSoat protein expression in pachytene primary spermatocytes a physiological role after puberty can be assumed.
Two further members of the SLC10 family, the NTCP and the ASBT, are important factors for the maintenance of the enterohepatic circulation between the liver and the gut. In spite of a high phylogenetic relationship to SOAT, distinct differences exist in the substrate specifity. While NTCP transports sulfoconjugated steroid hormones, bile acids and Estron-3beta-D-glucuronide, ASBT shows uptake only for bile acids, and SOAT only for sulfated steroids. For the first time, a substrate was discovered for all three transporters: the Taurolithocholic acid (TLC). Therefore, similarities in the substrate recognition of the binding sites between all three transporters have to exist. For SOAT, a nearly identical steric overlay of the sulfate group of DHEAS and the sulfone group of TLC could explain the substrate recognition of both. Lithocholic acid, unconjugated steroids and Estradiol-17betaD-glucuronide were not trans-ported by any of these three carriers.
For the generation of a pharmacophore model more than 100 compounds were screened for inhibition of DHEAS transport by SOAT-HEK293 cells. The 3D-QSAR SOAT pharmacophore calculated by the CATALYST algorithm consists of five characteristic features. The potent SOAT inhibitor taurolithocholic acid 3-sulfate (TLCS) mapped all of them: a) three hydropho-bic sites, one matches the A-Ring and two the methyl groups at positions 18 and 21 of TLCS; b) the sulfate group at position 3 and the sulfonyl group of the taurine residue act as hydro-gen bond acceptors. Comparison with the hitherto existing human ASBT, rabbit Asbt (cAsbt), and NTCP pharmacophore models revealed similarities, but also specific differences.
Alltogether 18 compounds, including testosterone and progesterone, caused a concentration dependent stimulation of DHEAS uptake. A physiological role of an enhanced uptake may be possible. For example, production of testosterone is abundant in testis, where SOAT is highly expressed. So at the beginning of the puberty a stimulation of the DHEAS uptake by testos-terone could lead to an elevated supply of DHEAS into the cells. The resulting increase of testosterone synthesis out of DHEAS may lead to a stimulating loop.
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