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Hypercapnia impairs cell junction formation by promoting TRAF2 E3 ligase-mediated ubiquitination and endocytosis of the Na,K-ATPase beta-subunit in alveolar epithelial cells

Hyperkapnie beeinträchtigt die Zell-Kontakt-Ausbildung durch die TRAF2 E3 Ligase-vermittelte Ubiquitinierung und Endocytose der Na,K-ATPase beta-Untereinheit in alveolaren Epithelzellen

Gabrielli, Nieves María


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-103251
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2013/10325/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik II
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 28.11.2013
Kurzfassung auf Englisch: INTRODUCTION: In patients with acute respiratory distress syndrome (ARDS) disruption of the epithelial barrier results in accumulation of edema fluid in the airspaces, impairing gas exchange and leading to elevated CO2 levels (hypercapnia). Moreover, lung-protective mechanical ventilation in patients often results in further hypercapnia. The formation of new cell-cell contacts after ARDS is essential for the re-establishment of an intact and functional alveolar epithelium, capable of clearing lung edema and performing gas exchange. The Na,K-ATPase beta-subunit is a cell-adhesion molecule with a key role in the formation and stability of cell junctions and therefore might be important in the repair of the alveolar epithelium. However, the effects of hypercapnia on the stability of the Na,K-ATPase beta-subunit and on the re-organization of adherens junctions have not been studied before. In the present work we tested the hypothesis that hypercapnia inhibits cell-cell contact formation by promoting the down-regulation of the Na,K-ATPase beta-subunit. We aimed to elucidate the molecular mechanism underlying the (dis)regulation of adherens junction formation by hypercapnia.
METHODS AND RESULTS: Exposing alveolar epithelial cells to elevated CO2 at constant extracellular pH of 7.4 led to the ubiquitination of the Na,K-ATPase beta-subunit at the plasma membrane which resulted in a significant reduction of the protein abundance at the cell surface, as determined by cell-surface biotinylation and confocal microscopy. Internalization of the Na,K-ATPase beta-subunit was followed by proteasome-dependent degradation of the protein, as assessed by pulse-chase experiments with impermeable biotin. The simultaneous mutations of lysines 5 and 7 of the Na,K-ATPase beta-subunit to arginine prevented hypercapnia-induced ubiquitination and endocytosis of the protein, demonstrating that ubiquitin chains covalently-attached to the Na,K-ATPase beta-subunit during hypercapnia act as an endocytosis signal. Mutation of serine 11 of the Na,K-ATPase beta-subunit to alanine prevented hypercapnia-induced ubiquitination and degradation of the protein. In contrast, mutation of serine 11 to aspartate which mimics phosphorylation did not prevent hypercapnia-induced effects, suggesting that phosphorylation of the Na,K-ATPase beta-subunit at serine 11 is a prerequisite for the ubiquitination of the protein. Coimmunoprecipitation and in vitro interaction studies showed that the serine/threonine kinase protein kinase C-zeta; (PKC-zeta), known to be activated by hypercapnia, interacted with the Na,K-ATPase beta-subunit and this interaction was dependent on the serine 11 of the Na,K-ATPase beta-subunit. Moreover, PKC-zeta activity was required for the hypercapnia-mediated effects, since the chemical inhibition or knock-down of the kinase prevented the endocytosis of the Na,K-ATPase beta-subunit under hypercapnic conditions. By the use of a protein-interaction microarray we identified the E3 ligase TRAF2 as an interactive partner for Na,K-ATPase beta-subunit. This interaction was further confirmed by coimmunoprecipitation and in vitro interaction studies. TRAF2 led to ubiquitination of the Na,K-ATPase beta-subunit in vitro and in vivo. Moreover, knock-down of TRAF2 prevented the hypercapnia-induced endocytosis of the Na,K-ATPase beta-subunit, demonstrating that TRAF2 is the E3 ligase that mediates the Na,K-ATPase beta-subunit ubiquitination in hypercapnia. Most importantly, by cell aggregation assays we demonstrated that hypercapnia led to impaired cell junction formation, effect that was prevented by the simultaneous mutations of lysines 5 and 7 of the Na,K-ATPase beta-subunit, demonstrating that hypercapnia-mediated down-regulation of the Na,K-ATPase beta-subunit at the plasma membrane is the underlying mechanism by which hypercapnia inhibits cell-cell adhesion.
CONCLUSIONS: Here we report a novel mechanism by which hypercapnia affects the function of the alveolar epithelium. We provide evidence that hypercapnia (independently of pH) promotes ubiquitination of the Na,K-ATPase beta-subunit at the plasma membrane leading to the endocytosis of the protein, which results in reduced ability of alveolar cells to form intercellular junctions. We demonstrate that ubiquitination depends on PKC-zeta activity and we identify TRAF2 as the E3 ligase that mediates the hypercapnia-induced ubiquitination of the Na,K-ATPase beta-subunit. Thus, hypercapnia may impair restoration of the alveolo-capillary barrier in patients with ARDS upon hypercapnia by the down-regulation of the Na,K-ATPase beta-subunit.
Kurzfassung auf Deutsch: EINLEITUNG: Die Schädigung der epithelialen Schranke in Patienten mit akutem Lungenversagen (engl. acute respiratory distress syndrome, ARDS) führt zur Ausbildung alveolärer Ödeme und folglich zu erhöhten CO2-Leveln (Hyperkapnie). Zudem kann die lungenprotektive Beatmung mit geringen Tidalvolumen Hyperkapnie induzieren. Zur Auflösung von ARDS ist daher die Ausbildung neuer Zell-Zell-Kontakte für die Wiederherstellung eines intakten und funktionalen alveolären Epitheliums, das zur Resorption der Ödemflüssigkeit und Aufnahme des normalen Gasaustausches in der Lage ist, essenziell. Die beta-Untereinheit der Na,K-ATPase ist ein Zelladhäsionsmolekül und spielt eine Schlüsselrolle in Ausbildung und Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Kontakten und kann daher auch als wichtige Komponente für die Wiederherstellung der alveolo-kapillaren Schranke von Interesse sein. Allerdings ist bisher nicht bekannt, inwieweit erhöhte CO2-Level einen Einfluss auf die Stabilität der Na,K-ATPase beta-Untereinheit und die Reorganisation von Adherens Junctions haben. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob und über welche molekularen Mechanismen Hyperkapnie die Regulation von Adherens Junctions reguliert und ob die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten durch eine Herunterregulation der Na,K-ATPase beta-Untereinheit inhibiert wird.
METHODEN AND ERGEBNISSE: Oberflächen-Biotinylierung und konfokale Mikroskopie alveolarer Epithelzellen zeigen, dass die Behandlung mit hohen CO2-Konzentrationen zu einer Ubiquitinierung der an der Plasmamembran befindlichen Na,K-ATPase beta-Untereinheit, und in Folge dessen zu einer signifikanten Reduktion der Häufigkeit dieser Untereinheit an der Plasmamembran führt. Pulse-Chase Experimente mit nicht-zellpermeablem Biotin demonstrieren, dass nach der Hyperkapnie-induzierten Internalisierung der Na,K-ATPase beta-Untereinheit eine proteosomale Degradation des Proteins folgt. Die gleichzeitige Mutation von Lysin 5 und 7 der Na,K-ATPase beta-Untereinheit verhindert die Hyperkapnie-induzierte Ubiquitinierung und Endozytose des Proteins. Die Mutation von Serin 11 der Na,K-ATPase beta-Untereinheit zu Alanin verhindert die Hyperkapnie-induzierte Ubiquitinierung und Degradierung, wohingegen die Mutation von Serin 11 zu Aspartat, was eine Phosphorylierung imitiert, die Hyperkapnie-induzierten Effekte nicht verhindert. Koimmunopräzipitation und in vitro Experimente zur Interaktion der Protein belegen, dass die PKC-zeta Serin/Threonin-Kinase, die bekannterweise während der Hyperkapnie aktiviert wird, mit der Na,K-ATPase beta-Untereinheit interagiert und diese Interaktion abhängig ist von Serin 11 der Na,K-ATPase beta-Untereinheit. Weiterhin verhindert die chemische Inhibition oder der knock-down von PKC-zeta die Hyperkapnie-induzierte Endozytose der Na,K-ATPase beta-Untereinheit. In einem Protein-Microarray zur Identifikation von Bindungspartnern der Na,K-ATPase beta-Untereinheit wurde die E3 Ligase TRAF2 gefunden, die auch in Koimmunopräzipitationsstudien und in in vitro Interaktionsstudien die Na,K-ATPase beta-Untereinheit bindet. TRAF2 induziert die Ubiquitinierung der Na,K-ATPase beta-Untereinheit in vitro und in vivo. Außerdem verhindert der Knock-down von TRAF2 die Hyperkapnie-induzierte Endocytose der Na,K-ATPase beta-Untereinheit. Durch Zellaggregationsassays konnten wir zeigen, dass Hyperkapnie zu gestörten Zell-Zell-Adhäsionen führt und dieser Effekt durch Mutation der Lysine 5 und 7 der Na,K-ATPase beta-Untereinheit verhindert werden konnte.
ERGEBNIS: In dieser Studie zeigen wir einen neuen Mechanismus auf, über den Hyperkapnie Einfluss auf die Funktion des alveolären Epitheliums nimmt. Wir belegen, dass Hyperkapnie unabhängig vom pH die Ubiquitinierung und infolgedessen die Endozytose der Na,K-ATPase beta-Untereinheit induziert, wodurch die Fähigkeit alveolarer Zellen zur Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten reduziert wird. Weiterhin demonstrieren wir, dass die Ubiquitinierung der Na,K-ATPase beta-Untereinheit von der Aktivität von PKC-zeta abhängt, und dass TRAF2 die E3 Ligase ist, die die Hyperkapnie-induzierte Ubiquitinierung vermittelt. Demzufolge könnte Hyperkapnie die Wiederherstellung der alveolo-kapillaren Schranke in Patienten mit ARDS durch eine Herunterregulation der Na,K-ATPase beta-Untereinheit behindern.
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