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Wechselwirkung mit und Aufnahme von Staphylococcus aureus Extracellular Adherence Protein (Eap) in Endothelzellen der Nabelschnur

Interaction with and uptake of Staphylococcus aureus Extracellular adherence protein (Eap) in endothelial cells of the umbilical cord

Janzen, Susanne


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-90444
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2012/9044/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Eap , Nabelschnur , Staphylokokkus aureus
Freie Schlagwörter (Englisch): Eap , umbilical cord , Staphylococcus aureus
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Zahnmedizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 09.11.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär vorkommendes Bakterium, dessen Infektionen oft mit schweren endovaskulären Krankheiten assoziiert sind. Die Ursache dafür sind verschiedene Virulenzfaktoren, u.a. das hier bearbeitete Extracellular Adherence Protein (Eap).
Eap erfüllt verschiedene Aufgaben: So führt es zu einer Adhärenz der S. aureus-Bakterien untereinander sowie auch der Adhäsion des Bakteriums an eukaryotische Zellen. Außerdem greift es in das Abwehrsystem des Menschen ein, um der humanen Immunantwort zu entgehen. Zudem besitzt es anti-inflammatorisches und anti-angiogenes Potenzial. Verschiedene Plasmaproteine wie Fibrinogen, Fibronektin und Vitronektin und auch ICAM-1 wurden als Bindungspartner für Eap identifiziert.
Ob Eap auch an andere Rezeptoren als ICAM-1 binden kann und was nach Bindung an den eukaryotischen Zellen passiert und ob Eap an der Oberfläche der Zellen verbleibt oder in die Endothelzellen und darüber hinaus aufgenommen wird, war Gegenstand dieser Arbeit.
Zur Beantwortung dieser Fragen wurden ex vivo-Experimente mit Gefäßen von Nabelschnüren, sowie in vitro-Experimente mit makrovaskulären Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Zellen und die V. umbilicalis der Nabelschnur wurden unter verschiedenen Bedingungen mit Eap inkubiert und anschließend Immunfluoreszenzbilder mikroskopisch ausgewertet. Durch Permeabilitätsassays wurde der Einfluss von Eap auf die Permeabilität von HUVEC untersucht. Um die Bindung von Eap an eukaryotische Zellen zu bestimmen, wurden Bindungsassays mit biotinyliertem Eap an HUVEC über das ELISA-Prinzip durchgeführt.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von Eap in das Zytoplasma von Endothelzellen abhängig von der Eap-Konzentration und der Inkubationszeit ist und nicht nur auf die Endothelzellen beschränkt bleibt, sondern auch in der ECM nachgewiesen wurde. Die Aufnahme von Eap war bei 4 °C und bei gleichzeitiger Inkubation von Eap mit Heparin stark reduziert. Heparansulfate auf den Zelloberflächen hatten einen begrenzten Einfluss auf die Internalisierung von Eap.
ICAM-1 war nach Eap-Inkubation in der V. umbilicalis reduziert darstellbar, was die Annahme von ICAM-1 als Bindungspartner von Eap unterstützt. Ebenfalls reduziert, jedoch meist nicht so stark wie ICAM-1 und auch nicht konzentrationsabhängig von Eap oder der Inkubationszeit, war PECAM-1. Dies läßt PECAM-1 als weiteren, aber weniger affinen, „Rezeptor“ für Eap vermuten.
Die Permeabilität eines HUVEC-Monolayers wurde jedoch durch Eap nur gering beeinflusst. Eap zeigte eine homogene Verteilung im Zytoplasma ab einer Konzentration von 5 µg/ml Eap und zudem eine perinukleäre Agglomeration. Der Kern blieb allerdings frei von Eap, was darauf hinweist, dass Eap zunächst nicht in den Kern wandert, sich aber dort anlagert.
Kurzfassung auf Englisch: Staphylococcus aureus is a prevalent bacterium; its infections are often associated with severe endovascular diseases because it expresses a variety of virulence factors, including the Extracellular Adherence Protein (Eap).
Eap leads not only to the adherence of S. aureus bacteria to each other but also mediates adhesion of the bacteria to eukaryotic cells. It also influences the immune system of its host and has anti-inflammatory and anti-angiogenic potential. Various plasma proteins such as fibrinogen, fibronectin, vitronectin and receptors like ICAM-1 were previously identified as binding partners for Eap.
This raises the question whether Eap can bind to receptors other than ICAM-1 and what happens after binding to the eukaryotic cells, whether Eap remains on the surface of cells or is internalized to the endothelial cells and beyond.
These questions were examined in ex vivo-experiments with veins of umbilical cords, as well as in in vitro-experiments with macrovascular endothelial cells (HUVEC). HUVEC and V. umbilicalis were incubated with Eap under different conditions and immunofluorescence images were evaluated microscopically. In addition, permeability assays were done to examine the permeability of HUVEC monolayers after incubation with Eap. To investigate the binding of Eap, binding assays of biotinylated Eap to HUVEC were carried out by the ELISA principle.
In this work it could be shown that the inclusion of Eap in the cytoplasm of endothelial cells is dependent on the concentration of Eap and time of incubation. The localisation Eap was not limited on the endothelial cells, because Eap could also be detected in the extracellular matrix. The inclusion of Eap was significantly reduced at 4 °C and in the case of simultaneous incubation of Eap with heparin. Heparan sulfates on the cell surface had a limited effect on the internalization of Eap.
ICAM-1 was reduced in the V. umbilicalis after incubation of the umbilical cord with Eap. That supports the assumption of ICAM-1 as a binding partner of Eap. PECAM-1 was also reduced, but usually not as strong as ICAM-1, and neither concentration dependent of Eap or of time of incubation. This suggests PECAM-1 as another, but rather nonspecific, ligand for Eap.
The permeability of HUVEC monolayers was affected only slightly by Eap, there was only a tendency towards an increasing permeability.
In regard to the localization of Eap inside the cell, at a concentration of 5 µg/ml Eap a homogeneous distribution in the cytoplasm could be shown. Although also a perinuclear agglomeration was visible, the core, however, remained free of Eap, suggesting that Eap does not initially moves into the nucleus, but adsorbs at the nucleus.
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