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Herstellung und Charakterisierung eines liposomalen Carriersystems für die inhalative Applikation von Sildenafil

Sattler, Laura


Originalveröffentlichung: (2012) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.236 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-89717
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2012/8971/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Pferde, Innere Medizin
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5933-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 12.09.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) des Menschen ist eine chronische Erkrankung, die nicht geheilt werden kann (Olschewski et al. 2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009). Sildenafil ist seit 2005 unter dem Handelsnamen Revatio® (Pfizer) zur oralen Behandlung der PAH zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit zugelassen (Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2009; Ramani und Park 2010). Nachteile der oralen Behandlung sind die mäßige Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs (Nichols et al. 2002; Sheu et al. 2003) und der verzögerte maximale Wirkeffekt, der erst 60 Minuten nach der Einnahme eintritt (Ghofrani et al. 2004c). Zudem konnte trotz der pulmonalen Selektivität des Wirkstoffs (Michelakis 2002; Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006) bei Versuchen mit Schafen bei höheren Dosen auch eine Senkung des systemischen arteriellen Druckes beobachtet werden (Weimann et al. 2000). Daraus ergibt sich die Überlegung, den Wirkstoff durch Inhalation direkt in die Lunge zu verbringen. Dadurch können hohe lokale Wirkstoffkonzentrationen bei minimalen systemischen Nebeneffekten erreicht werden. Außerdem wird durch die Inhalation ein schneller Wirkungseintritt erzielt (Le Brun et al. 2000; Khilnani und Banga 2008). Bei Schafen mit induzierter pulmonaler Hypertonie konnte durch die Inhalation von vernebeltem Sildenafil eine noch während der Inhalation eintretende selektive Senkung des pulmonalarteriellen Druckes (pulmonary artery pressure, PAP) erzielt werden, ohne dass es zu systemischen Nebenwirkungen kam. Ein Nachteil war aber die kurze Wirkdauer: der PAP stieg nach Beendigung der Inhalation innerhalb weniger Minuten wieder auf den Ausgangswert (Ichinose et al. 2001).
Ziel dieser Arbeit war es daher, eine liposomale Formulierung des lipophilen PDE 5-Inhibitors Sildenafil herzustellen und diese hinsichtlich ihrer Eignung als Controlled Release-Formulierung zur pulmonalen Applikation zu untersuchen.
Vorbereitend wurden Liposomen mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6G als Modellsubstanz nach vier verschiedenen Methoden hergestellt. Die Verkapselungseffizienzen (VE) lagen bei ca. 3,8 bis 7,6 %. Die Verkapselungsraten (VR) unterschieden sich mit ca. 95 bis 99 % kaum voneinander, ebenso wie die medianen Volumendurchmesser (VMD), die bei ca. 0,6 bis 0,8 µm lagen. Durch die Verneblung mit dem Vibrating Mesh-Vernebler Aeroneb® Solo veränderten sich die Charakteristika der Vesikel kaum. Aus der Farbstoffwiederfindung nach Aerosolisierung von ca. 90 bis 96 % konnte geschlossen werden, dass die Vesikel nahezu intakt und vollständig vernebelt werden konnten.
Mit der Herstellungsmethode, bei der der Farbstoff direkt in den Lipidfilm eingearbeitet wurde, war die VE am besten reproduzierbar. Diese Methode wurde daher gewählt und weiter optimiert, um damit Liposomen mit Sildenafil herzustellen. Diese wurden bezüglich ihrer Verkapselungseigenschaften und Größenverteilung charakterisiert. Die VE lag bei ca. 105 % und die VR bei ca. 98 %. Da die Vesikel nicht extrudiert werden konnten, lag der VMD mit ca. 3 µm deutlich über dem der Rhodamin 6G-Liposomen. Da sich die Sildenafil-Liposomen aus methodischen Gründen nicht mit dem Aeroneb® Solo vernebeln ließen, wurde die Verneblungsstabilität mit dem Düsenvernebler Pari LC Sprint® Star untersucht. Dabei änderten sich VR und VMD der Vesikel kaum. Die Wiederfindung des Wirkstoffs lag aufgrund der verneblerspezifischen Aufkonzentrierung durch Verdunstung bei ca. 107 % im aufgefangenen Aerosol und ca. 127 % im Verneblerrückstand. Der mittlere aerodynamische Massendurchmesser des mit dem Düsenvernebler generierten Aerosols lag bei ca. 3,5 µm. Auch diese Liposomen waren somit stabil gegenüber der Verneblung und das Aerosol schien gut für eine Deposition in peripheren Lungenregionen geeignet.
Bei in vitro Freisetzungsversuchen fiel auf, dass bereits zu Beginn der Versuche knapp 30 % des liposomal eingesetzten Sildenafils als freies Sildenafil vorlag. Im weiteren Versuchsverlauf kam es zu einem langsamen Anstieg des freien Sildenafils auf gut 60 % nach 270 Minuten.
Durch diese verzögerte Freisetzung erschienen die Liposomen geeignet, um im Modell der isolierten, ventilierten und perfundierten Kaninchenlunge getestet zu werden. Dafür wurden die Übertrittskinetiken von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil verglichen. Bei den Versuchen mit freiem Sildenafil trat der Wirkstoff erwartungsgemäß sehr schnell in das Perfusat über, sodass bereits nach zehn Minuten eine maximale Konzentration von 1,33 µg/ml (ca. 42 % der deponierten Menge) erreicht wurde. Danach blieb die Konzentration relativ konstant bis zum Versuchsende nach fünf Stunden. Die Konzentrations-Zeit-Kurve von liposomal verkapseltem Sildenafil lag insgesamt etwas unterhalb der Kurve von freiem Sildenafil, die Kinetiken der beiden Kurven waren aber ähnlich. Bereits nach fünf Minuten wurde eine Konzentration von 1,09 µg/ml (ca. 32 % der deponierten Menge) erreicht, die bis zum Ende des Versuches relativ konstant bei 1,1 µg/ml blieb. Die AUC der Versuche mit liposomalem Sildenafil unterschied sich nicht signifikant von der AUC der Versuche mit freiem Wirkstoff. In der Lunge muss es also zu einer schnellen Freisetzung des Wirkstoffs aus den Vesikeln gekommen sein, weshalb diese sich trotz der vielversprechenden in vitro-Vorversuche nicht als Retardformulierung zur inhalativen Applikation von Sildenafil eignen.
Kurzfassung auf Englisch: Human Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic disease without cure (Olschewski et al. 2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009). Sildenafil (Revatio®; Pfizer) was approved in 2005 for the oral treatment of PAH with the aim of strengthening the patients´ physical endurance (Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2009; Ramani und Park 2010). Drawbacks of an oral treatment are the rather poor bioavailability of the agent (Nichols et al. 2002; Sheu et al. 2003) and the delay of 60 minutes after intake until its maximum effect unfolds (Ghofrani et al. 2004c). Furthermore, despite the agent´s pulmonary selectivity (Michelakis 2002; Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006), a decrease in systemic artery pressure was observed in trials with sheep, when high doses were administered (Weimann et al. 2000). This led to the conclusion that the drug should rather be directly conveyed into the lung by means of inhalation. As a result, a high local drug concentration can be achieved with concurrent reduction of systemic side effects. Also, the inhalation ensures a rapid onset of effects (Le Brun et al. 2000; Khilnani und Banga 2008). The inhalation of aerosolized Sildenafil caused a selective decrease of pulmonary artery pressure (PAP) in sheep with induced pulmonary hypertension during inhalation without the occurence of systemic side effects. However, the treatment´s effect was very short: the PAP rose back to its initial level a few minutes after the inhalation had ceased (Ichinose et al. 2001).
The aim of this study therefore was to produce a liposomal carrier of the lipophilic PDE 5-inhibitor Sildenafil and to analyse this formulation with regard to its aptitude as a controlled release formulation for pulmonary application.
In first experiments, liposomes with a model substance, the lipophilic fluorescence dye rhodamine 6G, were prepared using four different production processes. The encapsulation efficiencies amounted to 3.8 to 7.6 %. Both, the encapsulation rates (approximately 95 – 99 %) and the volume mean diameters (VMD of 0.6 to 0.8 µm) varied only slightly. The nebulization of the liposomes, for wich a vibrating mesh-nebulizer (Aeroneb® Solo, Aerogen, Dangan, Galway, Ireland) was used, had hardly any effect on the characteristics of the vesicles. The recovery of the fluorescent dye after aerosolization, which was 90 – 96 %, indicates that the vesicles were aerosolized nearly intact and complete.
The most appropriate method for producing liposomes with a reproducible encapsulation efficiency proved to be the direct application of the fluorecscent dye into the lipid film. Consequently, this method was chosen and further improved for preparing Sildenafil containing liposomes. These were characterised in terms of their encapsulation properties and size distribution. An encapsulation efficiency of about 105 % and an encapsulation rate of 98 % was determined. Since the extrusion of these liposomes proved impossible, the VMD of 3 µm considerably exceeded that of the Rhodamine 6G-liposomes. The stability towards nebulization was tested by means of a jet nebulizer (Pari LC Sprint® Star, PARI GmbH, Starnberg, Germany), because technical reasons prevented the nebulization of the sildenafil liposomes with the Aeroneb® Solo. In the process, the encapsulation rate and VMD of the vesicles were only slightly altered. The recovery of the drug attained a level of approximately 107 % in the collected aerosol and approximately 127 % in the residue of the nebulizer. The increase in drug concentration was due to the solvent evaporation specific to the nebulizer. The mass median aerodynamic diameter of the aerosol produced by the jet nebulizer was approximately 3.5 µm. These liposomes, too, were therefore proved to be stable during nebulization and the aerosol seemed to be well suited for deposition in periphery lung regions.
During in vitro drug release, it was established that even at the beginning of the experiment, nearly 30 % of free Sildenafil was detected, indicating that the substance was no longer incorparated in the liposomes. In the course of the experiments, a slow further increase of the free Sildenafil to 60 % of the incorporated substance ensued after 270 minutes.
As a consequence of this controlled release, the liposomes seemed to be suited for being tested in the isolated, ventilated and perfused rabbit lung. The absorption kinetics of free and liposomally encapsulated Sildenafil were compared. As expected, in experiments with free Sildenafil the drug was rapidly absorbed into the perfusion fluid. As early as ten minutes into the experiment, a maximum concentration of 1.33 µg/ml (approximately 42 % of the deposited amount) was reached. Afterwards, the concentration remained relatively constant until the end of the experiment after five hours. The concentration over time curve for the liposomally encapsulated Sildenafil ran below the curve for free Sildenafil, but the kinetics of the curves were similar. After five minutes already, a concentration of 1.09 µg/ml (approximately 32 % of the liposomally deposited amount) was reached. A steady-state was established at 1.1 µg/ml, which lasted up to the end of the experiment. The AUC of the experiments with liposomally encapsulated Sildenafil did not differ significantly from the AUC of the experiments with the free drug. It therefore has to be assumed that in the lung the drug was rapidly set free from the vesicles. In conclusion, despite the promising preliminary tests in vitro, these liposomes were not suited as a controlled release formulation for Sildenafil inhalation.
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