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Evaluierung verschiedener Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma

Klaus, Daniela


Originalveröffentlichung: (2012) Giessen : VVB Laufersweiler
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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-89427
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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5924-8
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 10.09.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die künstliche Besamung gewinnt in der Hundezucht immer mehr an Bedeutung.
Dabei können durch die Verwendung von flüssigkonserviertem Sperma selbst bei
vaginaler Deponierung des Samens i. d. R. deutlich bessere Trächtigkeitsraten
und höhere Wurfgrößen erzielt werden als mit kryokonserviertem Sperma, ein
optimales Besamungsmanagement vorausgesetzt. Zudem ist die Flüssigkonservierung von Sperma hinsichtlich Herstellung und Versand einfacher und kostengünstiger als die Kryokonservierung. Limitierend beim Einsatz von flüssigkonserviertem Sperma ist jedoch die begrenzte Überlebensdauer der Samenzellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample-Verfahren drei verschiedene Verdünner für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C
vergleichend untersucht. Dabei handelte es sich um den kommerziellen Verdünner
CaniPRO™ Chill 10 (CP) und zwei nichtkommerzielle Verdünner (TRIS-Fruktose-
Eigelb-Verdünner (TE) und Uppsala Equex-2 System). Beim zweiphasigen
Uppsala Equex-2 System waren zwei Versuchsteile zu unterscheiden: In
Versuchsteil I erfolgte die Verdünnung mit Verdünner 1 und Verdünner 2 des
Uppsala Equex-2 Systems (Up 1 + 2), in Versuchsteil II nur mit Verdünner 1 (Up 1).
Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, den am besten geeigneten
Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma bei 4°C über einen
Lagerungszeitraum von zehn Tagen zu bestimmen. Zudem sollte geprüft werden,
wie lange eine akzeptable Spermaqualität in den verdünnten Ejakulaten
aufrechterhalten werden kann. Dazu wurde von 30 Rüden jeweils ein Ejakulat
fraktioniert gewonnen und die spermienreiche Fraktion mittels klassischer und
moderner spermatologischer Untersuchungsmethoden (CASA-System SpermVision™) hinsichtlich Motilität (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
(VW), CASA-Gesamtmotilität (GMCASA), CASA-Vorwärtsbeweglichkeit (VWCASA)),
Viabilität (Lebend-Tot-Anteil im Eosinausstrich (Lebende), CASA-Viabilität nach
SYBR-14/PI-Färbung (ViaCASA)), Pathomorphologie (Eosinausstrich; Patho),
akrosomaler Veränderungen (Spermac®-Färbung; AV) und funktioneller Integrität
der Plasmamembran (Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS-Test;
HOS) beurteilt. Im Anschluss wurden die Ejakulate in drei Aliquote geteilt und es erfolgte die Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern. Unmittelbar nach der Herstellung (Tag 0) wurden in den verdünnten Ejakulaten die gleichen
Beurteilungsparameter untersucht wie in den Nativejakulaten. Nach 1, 2, 3, 5, 7
und 10 Tagen Lagerung bei 4°C wurden 100 Pl-Aliquote der verdünnten Ejakulate
für fünf Minuten im Wasserbad auf 37°C angewärmt und anschließend hinsichtlich
VW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA, Patho und AV beurteilt.
Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischen
den verschiedenen Rüden. Die durchschnittlich ermittelten Werte waren: VW
80,8 ± 9,5 %, GMCASA 70,9 ± 18,1 %, VWCASA 65,0 ± 19,9 %, Lebende 87,4 % (80,6-
92,9 %), ViaCASA 82,7 % (71,0-91,9 %), Patho 10,3 % (SF = 1,66), AV 2,7 %
(SF = 2,63) und HOS 3,1 % (SF = 2,34). Durch die Verdünnung mit den
verschiedenen Verdünnern wurden die untersuchten Parameter mit Ausnahme
von HOS (CP: 5,0 % (SF = 2,23); TE: 4,7 % (SF = 2,12); Up 1 + 2: 8,0 %
(SF = 2,16); Up 1: 4,3 % (SF = 1,69) nicht wesentlich beeinflusst (Tag 0).
Insgesamt nahm die Spermaqualität über den Untersuchungszeitraum von zehn
Tagen jedoch in allen verdünnten Ejakulaten kontinuierlich ab. Die
Flüssigkonservierung bewirkte in allen verdünnten Ejakulaten eine signifikante
Reduktion der Motilität (VW, GMCASA, VWCASA), eine signifikante Verlangsamung
der Spermiengeschwindigkeit und eine signifikante Verminderung der Viabilität
(Lebende, ViaCASA), wohingegen es in fast allen verdünnten Ejakulaten zu einer
geringgradigen, aber signifikanten Zunahme der Pathomorphologie und zu einem
signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungen
kam. Ausgehend von einer initialen VW von 77,8 ± 11,4 % (CP) / 77,2 ± 14,3 %
(TE) / 73,8 ± 18,0 % (Up 1 + 2) / 75,8 ± 13,8 % (Up 1) unmittelbar nach der
Herstellung (Tag 0) war nach zehn Tagen noch eine VW von 58,2 ± 22,1 % (CP) /
49,3 ± 23,9 % (TE) / 3,5 ± 4,6 % (Up 1 + 2) / 16,2 ± 12,1 % (Up 1), nachweisbar. Die ViaCASA an Tag 0 betrug 84,3 % (71,4-93,8 %) (CP) / 83,6 % (69,6-93,9 %) (TE) / 75,2 % (57,0-89,6 %) (Up 1 + 2) / 85,1 % (76,5-92,0 %) (Up 1) und verminderte sich über den Untersuchungszeitraum auf 58,8 % (41,7-74,9 %) (CP) / 59,7 % (40,8- 77,3 %) (TE) / 37,7 % (22,2-54,6 %) (Up 1 + 2) / 68,0 % (57,6-77,5 %) (Up 1) an Tag 10. Demgegenüber nahm die Patho zwischen Tag 0 (CP: 7,4 % (SF = 2,21); TE: 8,2 % (SF = 1,93); Up 1 + 2: 7,9 % (SF = 2,08); Up 1: 9,3 % (SF = 1,72)) und Tag 10 (CP: 10,7 % (SF = 2,04); TE: 10,7 % (SF = 2,19); Up 1 + 2: 9,8 % (SF = 2,26); Up 1: 10,6 % (SF = 1,96)) zu und auch für die AV konnte mit Ausnahme der mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate ein Anstieg zwischen Tag 0 (CP: 4,2 % (SF = 2,43); TE: 3,9 % (SF = 2,67); Up 1 + 2: 6,6 % (SF = 2,18); Up 1: 2,8 % (SF = 2,34)) und Tag 10 (CP: 7,6 % (SF = 2,57); TE: 8,5 % (SF = 2,14); Up 1 + 2: 4,0 % (SF = 2,72); Up 1: 8,2 % (SF = 1,78)) beobachtet werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten für eine Lagerungsdauer von zehn Tagen eine akzeptable Spermaqualität aufrechterhalten werden konnte. Die Motilität (VW, GMCASA, VWCASA) sowie die Spermiengeschwindigkeit waren über den Untersuchungszeitraum im Verdünner CP signifikant höher als in den anderen getesteten Verdünnern. Bezüglich der Viabilität (Lebende, ViaCASA) erwies sich im Zeitverlauf der Verdünner Up 1 als signifikant überlegen. Bei Betrachtung der Pathomorphologie war der Verdünner Up 1 + 2 signifikant besser als der Verdünner CP und Letzterer wiederum signifikant besser als der Verdünner TE. Hinsichtlich der akrosomalen Veränderungen konnten mit dem Verdünner Up 1 signifikant bessere Ergebnisse erzielt werden als mit dem Verdünner CP. Insgesamt betrachtet wurde die Spermaqualität und insbesondere die Motilität jedoch im Verdünner CP am besten konserviert, auch wenn die Unterschiede zu den anderen getesteten Verdünnern nicht für alle Parameter signifikant waren. Aufgrund dessen scheint der Verdünner CP den anderen getesteten Verdünnern überlegen und wird daher für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C empfohlen.
Da in der vorliegenden Arbeit allerdings ungeklärt bleibt, inwieweit sich die
Fertilität des flüssigkonservierten Spermas im Zeitverlauf verändert und welche
Auswirkungen die getesteten Verdünner auf den Erhalt der Befruchtungsfähigkeit
der Samenzellen haben, sind weitere Studien notwendig, um den Erhalt der
Befruchtungsfähigkeit während der Langzeit-Flüssigkonservierung in vivo und in
vitro näher zu charakterisieren.
Kurzfassung auf Englisch: The importance of artificial insemination in dog breeding has significantly
increased during the last decade. Using chilled semen, higher pregnancy rates
and litter sizes can be achieved compared to the use of cryopreserved semen,
even after vaginal deposition, provided that there is an optimal insemination
management. Furthermore, with regard to production and shipping, chilling of
semen is easier to perform and cheaper than cryopreservation. However, the
limited life span of sperm cells after chilling is limiting the use of extended semen.
In the present study, three different extenders were compared using split-sample
technique for chilling of canine semen and storage at 4°C. It concerned the
commercial extender CaniPRO™ Chill 10 (CP) and two non-commercial extenders
(TRIS-fructose-egg yolk extender (TE) and Uppsala Equex-2 system). With the
two-phase Uppsala Equex-2 system, two test parts have to be distinguished: In
part I of the experiment, both extenders (Up 1 + 2) were used for dilution; whereas in part II of the experiment only extender 1 was used (Up 1). The aim of this study was to determine the most suitable extender for chilling of dog semen over a storage period of ten days at 4°C. In addition, it should be tested how long an acceptable semen quality can be maintained in the diluted samples. Therefore, from each of 30 males one fractionated ejaculate was collected and the sperm rich fraction was examined by means of classical and modern spermatological investigation methods (CASA-system SpermVision™) for motility (subjectively estimated progressive motility (VW), total motility determined by CASA (GMCASA), progressive motility determined by CASA (VWCASA)), viability (live-dead ratio in eosin-stained smears (Lebende), viability determined by CASA after staining with SYBR-14/PI (ViaCASA)), pathomorphology (eosin-stained smears; Patho), acrosomal changes (staining with Spermac®; AV) and functional integrity of the plasma membrane (percentage of sperm cells with membrane defects in the HOS test; HOS). Subsequently, the sperm rich fractions were divided into three equal aliquots and processed with the different extenders. Immediately after dilution (day 0) the same parameters were examined in the diluted ejaculates as in the native semen samples. After 1, 2, 3, 5, 7 and 10 days of storage at 4°C, aliquots of 100 Pl of the diluted ejaculates were pre-warmed at 37°C in the water bath for five minutes and subsequently examined for VW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA, Patho and AV.
In the fresh ejaculates, the investigated parameters varied between different
males. The average values were: VW 80.8 ± 9.5 %, GMCASA 70.9 ± 18.1 %, VWCASA
65.0 ± 19.9 %, Lebende 87.4 % (80.6-92.9 %), ViaCASA 82.7 % (71.0-91.9 %), Patho
10.3 % (DF = 1.66), AV 2.7 % (DF = 2.63) and HOS 3.1 % (DF = 2.34). With the
exception of HOS (CP: 5.0 % (DF = 2.23); TE: 4.7 % (DF = 2.12); Up 1 + 2: 8.0 %
(DF = 2.16); Up 1: 4.3 % (DF = 1.69)), the investigated parameters were not
substantially influenced by the dilution with the different extenders (day 0).
However, overall semen quality of the diluted semen samples decreased
continuously during the observation period of ten days. Chilling of ejaculates
caused a significant reduction of motility (VW, GMCASA, VWCASA), a significant
slowing down of sperm velocity and a significant decrease in viability (Lebende,
ViaCASA), whereas in almost all diluted ejaculates there was a slight, but significant increase in pathomorphology and a significant augmentation in the proportion of sperm cells with acrosomal changes. Starting from an initial VW of 77.8 ± 11.4 % (CP) / 77.2 ± 14.3 % (TE) / 73.8 ± 18.0 % (Up 1 + 2) / 75.8 ± 13.8 % (Up 1) immediately after dilution (day 0), after ten days there was still a VW of 58.2 ± 22.1 % (CP) / 49.3 ± 23.9 % (TE) / 3.5 ± 4.6 % (Up 1 + 2) / 16.2 ± 12.1 % (Up 1). ViaCASA on day 0 was 84.3 % (71.4-93.8 %) (CP) / 83.6 % (69.6-93.9 %) (TE) / 75.2 % (57.0-89.6 %) (Up 1 + 2) / 85.1 % (76.5-92.0 %) (Up 1) and decreased during the observation period to 58.8 % (41.7-74.9 %) (CP) / 59.7 % (40.8-77.3 %) (TE) / 37.7 % (22.2-54.6 %) (Up 1 + 2) / 68.0 % (57.6-77.5 %) (Up 1) on day 10. In contrast, Patho increased from day 0 (CP: 7.4 % (DF = 2.21); TE: 8.2 % (DF = 1.93); Up 1 + 2: 7.9 % (DF = 2.08); Up 1: 9.3 % (DF = 1.72)) to day 10 (CP: 10.7 % (DF = 2.04); TE: 10.7 % (DF = 2.19); Up 1 + 2: 9.8 % (DF = 2.26); Up 1: 10.6 % (DF = 1.96)) and also for AV, there was with the exception of the ejaculates diluted with Up 1 + 2 an increase from day 0 (CP: 4.2 % (DF = 2.43); TE: 3.9 % (DF = 2.67); Up 1 + 2: 6.6 % (DF = 2.18); Up 1: 2.8 % (DF = 2.34)) to day 10 (CP: 7.6 % (DF = 2.57); TE: 8.5 % (DF = 2.14); Up 1 + 2: 4.0 % (DF = 2.72); Up 1: 8.2 % (DF = 1.78)). These results show that in the ejaculates diluted with CP and TE, an acceptable semen quality could be maintained for a storage period of ten days.
During the observation period, motility (VW, GMCASA, VWCASA) and sperm velocity
were significantly higher in samples extended with CP than in samples extended
with the other extenders tested. Regarding viability (Lebende, ViaCASA) over time,the Up 1 extender proved to be significantly superior to the other extenders.
Concerning pathomorphology, the Up 1 + 2 extender was significantly better than
the CP extender and the latter in turn significantly better than the TE extender.
With regard to the acrosomal changes, significantly better results could be
obtained with the Up 1 extender than with the CP extender. However, overall
semen quality and in particular motility was best preserved in the CP extender,
even if the differences to the other extenders tested were not significant for all the parameters. Due to these results, the extender CP seems to be superior to the other extenders tested and is therefore recommended for chilling of canine semen at 4°C.
However, as in the present study it remained unclear to what extent the fertility of the chilled, extended semen changes over time and what effects the extenders tested have on preservation of the fertilizing capacity of the sperm cells, further studies are necessary to characterize the preservation of the fertilizing capacity in vivo and in vitro.
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