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Isolierung und Charakterisierung eines zytopathogenen Picornavirus aus verschiedenen Landschildkrötenspezies im Zusammenhang mit juveniler Panzererweichung

Heuser, Wenke


Originalveröffentlichung: (2012) Giessen: DVG Service
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.472 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-88653
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2012/8865/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Virus X , Schildkröten , Panzererweichung , tortoise picornavirus 1
Freie Schlagwörter (Englisch): virus x , tortoise , shell softening , tortoise picornavirus 1
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Tiere (Zoologie)
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-86345-076-2
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 02.07.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung, ob es andere, als die bisher bekannten Ursachen für das Krankheitsbild juvenile Panzererweichung gibt. Für meine Untersuchungen habe ich einen Betsand ausgewählt, welcher seit einiger Zeit Probleme mit juveniler Panzererweichung hatte. In diesem Bestand waren nur Jungtiere der Spezies Testudo graeca und Geochelone elegans betroffen.
Nicht erkrankt waren juvenile Landschildkröten der Spezies Testudo hermanni, Testudo marginata und Agronemys horsfieldii. In diesem Schildkrötenbestand konnte ich Fehler in Haltung und Fütterung mit großer Sicherheit ausgeschließen. Es wurden von mir zunächst acht juvenile Landschildkröten (sieben Test. graeca und eine G. elegans) untersucht. Diese Tiere hatten alle einen sehr weichen Panzer, welcher auf leichten Druck der Finger deutlich nachgab. In der Sektion wurden jedem Tier acht Organe (Gehirn, Zunge, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz und Darm) für die virologische und mikrobiologische Untersuchung entnommen.
Die adulten Tiere verschiedener Spezies wurden ebenfalls klinisch untersucht und ich habe insgesamt 104 Tupferproben (18 Konjuntival, 43 Rachen-, 43 Kloakentupfer) für die virologische Untersuchung in Zellkultur entnommen. Ich habe folgende Zelllinien eingesetzt: TH-1 (Terrapene heart cells), VH-2 (Russels viper heart cells) HEF- (Hühnerembryofibroblasten), HELZ-Kulturen, sowie auf MDBK (madin darby bovine kidney). Zusätzlich habe ich noch von 19 adulten Tieren Blutserumproben im Virusneutralisationstest auf die Bildung neutralisierender Antikörper untersucht.
Bei allen 64 Organproben und bei 79 Tupferproben konnte ein zytopathischer Effekt in der TH-1 Zellkultur beobachtet werden. Zwei bis drei Tage post infectionem begannen sich die Zellen teilweise abzurunden und es enstanden Lücken im Zellrasen. Nach etwa sieben Tagen war der komplette Zellrasen lytisch. In den anderen eingesetzten Zelllinien war kein zytopathischer Effekt zu sehen. Für eine weitere Charakterisierung wurden folgende fünf Isolate mit den Tagebuchnummern 402/1; 402/2; 1243/37; 1243/62; 1443/1 ausgewählt. Diese habe ich hinsichtlich ihrer Vermehrungsfähigkeit in Anwesenheit von Chloroform, IUDR, Aktinomycin D überprüft.
Außerdem wurden zwei Isolate hinsichtlich pH-Stabilität untersucht. Diese beiden Isolate wurden auch elektronenmikroskopisch untersucht. Ein Isolat (1243/37 Zu) wurde sequenziert.
Das Virus erwies sich als chloroformstabil, auch die Zugabe von IUDR und Aktinomycin D zum Kulturmedium führten nicht zu einer Hemmung der Virusvermehrung. Bei der Prüfung der pH-Stabilität zeigte sich bei pH=3 bis pH=7 keine Hemmung der Virusvermehrung, wohingegen ein pH=12 zu einem deutlichen Verlust der Infektiosität führte. Im Elektronenmikroskop stellten sich die Viruspartikel als klein (20-25nm), rund und mit undeutlicher Kapsomerenstruktur dar.
Die Gesamtheit der eigenen Ergebnisse zeigt, dass aus den erkrankten juvenilen Landschildkröten in großer Häufigkeit ein bisher nicht näher beschriebenes, kleines, unbehülltes, säurestabiles aber alkalilabiles, einzelsträngiges RNS-Virus nachgewiesen werden konnte. Aufgrund der biologischen, physiko-chemischen und morphologischen Eigenschaften wird eine Zugehörigkeit der Isolate zur Familie Picornaviridae postuliert.
Die durchgeführte Sequenzierung des Genoms eines ausgewählten Isolats konnte diesen Verdacht bestätigen. Es läßt sich auch aufgrund der Sequenzierungsdaten der Familie der Picornaviridae zuordnen, jedoch noch nicht in eines der bestehenden Genera.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit erstmalig ein Virus aus zwei Spezies juveniler Landschildkröten mit Panzererweichung isoliert und charakterisiert werden, welches alle Eigenschaften der Viren der Familie Picornaviridae besitzt und sehr wahrscheinlich einem neuen Genus innerhalb dieser Familie zugeordnet werden kann.
Im Virusneutralisations-Test konnten in 17 der 19 untersuchten Blutplasmaproben von adulten Landschildkröten aus sieben verschiedenen Spezies Antikörpertiter in einer Höhe von log2 = 3 bis log2 = 8 nachgewiesen werden. Nur 2 Tiere wiesen einen Titer von log2 < 2 auf. Die adulten Tiere waren bis auf eine Pantherschildkröte (Geochelone pardalis) mit leichter Konjunktivitis und eine Indische Sternschildkröte (Geochelone elegans) mit Rhinitis klinisch völlig unauffällig.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this work is to find more than the common possibilities for shell-softening in juvenile tortoise. All of the examined tortoises are from the same breeder. Shell softening was only displayed in juvenile tortoise of two species: Testudo graeca and Geochelone elegans. The other juveniles from the species Testudo hermanni, Testudo marginata und Agronemys horsfieldii in this stock did not show any clinical symptoms. Already known mistakes in keeping and feeding or bacterial, fungal and parasitic agents could be excluded as a reason for this juvenile shell softening.
From 34 throat, 34 cloacal and 11 conjunctival swabs from adult tortoise without clinical signs and from the organ samples (brain, tongue, lung, heart, liver, kidneys and spleen) of 8 died juvenile tortoise with shell softening and rachitis-like symptoms I found in TH-1 cell culture incubated at 28°C a cytopathogenic agent. No cytopathic effect was found in other used cell lines: VH2, chicken embryo fibroblast, chicken embryo liver cells and Madin Darby bovine kidney cells. The next step was to characterize this “new” founded virus more closely.
Therfore we used from 49 adult and 8 juvenile tortoise 104 swabs and 64 organ samples. All of them lived at the same breeder. All swab samples and the 19 blood samples are taken from the adults and the organ samples are from died juvenile tortoise with shell softening. The 19 citrat-blood samples were testet in the virus neutralization test against the isolate 1243/37 Zu.
Clinical signs could be found in juvenile Testudo graeca and Geochelone elegans, all of them displayed a very soft shell. Juvenile tortoises from other species in the same location remained completely healthy and free of clinical signs. The suitability for virus isolation was tested in different cell cultures TH-1, VH-2, MDBK, CEF und CELZ. All of the 64 organ samples from brain, tongue, lung, heart, liver, kidney, spleen and intestine and 79 from the 104 swab samples I found two till three days post infectionem a cytopathic effect only in the TH-1 cell line. The cell monolayer was nearly completely destroyed. All other inoculated cell cultures remained free of CPE during the total incubation period of two weeks. All tested isolates are resistant to chloroform treatment. The cultivation of the isolates in the presence of 5-iodo-2desoxyuridine and actinomycin D had no deleterious effect on the cytologic morphology. All results indicate that this cytopathogenic agent is an unenveloped, single stranded RNA virus. In the electronmicroscopy founded partikels were very small (20-25 nm) unenveloped, spherical shaped particles with an icosaehedral capsid. The virus replication was stable at a range of pH = 3 to pH = 7, and at a pH of 12 a drastically reduced infectivity was detected.
All results of the own examinations indicate that I isolated from all organ samples of juvenile tortoise with shell softening a very small, unenveloped acid-stabil single-stranded RNA virus.
Based on the biological, physic-chemical and morphological characteristics I postulate that these isolates are a member of the family Picornaviridae. The results of sequencing of one isolate provide evidence for the incorporation as a member of the family Picornaviridae. At the moment, it is not possible to place this isolate in any of the existing genera of the family Picornaviridae.
I can say that we found in this work a new virus in two different spezies of tortoise with shell softening which has all attributes to be a member of the family Picornaviridae.
For the virus neutralisation test I took from 19 adult tortoise (seven different species) citrate blood samples. In 17 from 19 citrat blood samples I had titres ranging from log2= 2 bis log2= 8. Only two of them had a titer of log2 <2.
Only two adult tortoises have clinical symptoms. One Geochelone pardalis with conjunctivitis and one Geochelone elegans with rhinitis.
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