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Molekularbiologische Untersuchung des CAG-Repeats des humanen Androgenrezeptors und Korrelation mit der Histologie der Spermatogenese - Ist das CAG-Repeat ein molekularer Marker für männliche Infertilität?

Fietz, Daniela Christa


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-85872
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2012/8587/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 24.01.2012
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Doktorarbeit sollte geklärt werden, inwieweit ein Zusammenhang zwischen dem polymorphen CAG-Repeat des humanen Androgenrezeptors (AR) und a) der Histologie der ungestörten und auch gestörten Spermatogenese, b) der AR- und ABP-Expression selbst und c) der Testosteronkonzentration im Blut besteht.
Das CAG-Repeat ist bekannt durch die spino-bulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy’s Disease), die neben den neuro-muskulären Degenerationen mit einer Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit einhergeht. Bei dieser Erkrankung ist zudem das Vorkommen von Mosaiken bekannt, d.h. das Auftreten unterschiedlich langer CAG-Repeats im AR-Gen verschiedener Gewebe. Es stellte sich die Frage, ob auch ein moderat verlängertes, aber immer noch innerhalb der physiologischen Grenzen liegendes CAG-Repeat Einfluss auf die männliche Fertilität nehmen kann. Darüber hinaus war fraglich, ob die Bestimmung des Trinukleotidrepeats aus dem Blut als diagnostisches Werkzeug verwendet werden kann, oder ob zwischen den Kompartimenten Blut und Hoden bzw. innerhalb der Zellpopulationen im Hoden selbst ein somatisches Mosaik besteht.
Deswegen untersuchten wir das CAG-Repeat nicht nur in der DNA aus Blutlymphozyten, sondern auch in den Zellpopulationen des Hodens auf DNA- und mRNA-Ebene. Einzelne Zellpopulationen konnten durch die Technik des Laser-assistierten Zellpickings (LACP) isoliert voneinander gewonnen und untersucht werden. Verwendet wurden zwei verschiedene Techniken zur Bestimmung des CAG-Repeats. Zum wurde die Fragmentlängenanalyse als Standardmethode durchgeführt, zum anderen die in diesem Zusammenhang neue native Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE).
Wir konnten Folgendes mit unseren Untersuchungen zeigen:
a) alle von uns bestimmten Repeats waren innerhalb der physiologischen Grenzen
b) es gibt keinen Zusammenhang zwischen dem CAG-Repeat und dem histologisch definierten Spermatogenesestatus
c) die AR-Expression im Hoden ist unabhängig von Spermatogenesestörungen und CAG-Repeatlänge
d) die ABP-Expression ist bei Spermatogenesestörungen signifikant herunterreguliert, aber ebenfalls unabhängig von der CAG-Repeatlänge
e) die CAG-Repeatbestimmung innerhalb der physiologischen Grenzen ist anfällig für Störungen der Polymeraseaktivität durch Bildung von DNA-Sekundärstrukturen
f) bei Patienten mit einer bunten Atrophie der Spermatogenese können Unterschiede in der CAG-Repeatlänge zwischen Sertolizellen auftreten, die aus Tubuli mit normaler und gestörter Spermatogenese stammen
Störungen in der Replikation und Transkription können durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen Guanin und Cytosin bei CAG-Repeats leicht entstehen und sind als Ursache von Replikationsabbrüchen bei Bakterien und Hefen schon lange bekannt.
Weitere Untersuchungen in der Arbeitsgruppe sollen klären, inwieweit auch im physiologischen Rahmen liegende CAG-Repeats die Expression von Zielgenen des AR beeinflussen können und ob es eine optimale CAG-Repeatlänge für die AR- Funktion gibt.
Kurzfassung auf Englisch: It was the aim of this doctoral thesis to elucidate, whether there is a connection between the polymorphic CAG repeat of the human androgen receptor (AR) and a) normal and impaired spermatogenesis, b) AR and ABP expression itself and c) testosterone concentration in the peripheral blood.
The CAG repeat has gained interest in the context of spinal bulbar muscular atrophy (SBMA, Kennedy’s disease), which is not only characterized by neuromuscular degeneration but also impairment of fertility in men. In SBMA, mosaics are known to occure, meaning that distinct CAG repeat lengths in the AR gene in different tissues exist. It is in question, whether also moderate expanded but still physiological CAG repeats may influence spermatogenesis. At the same time it is questionable, if the determination of CAG repeat length in peripheral blood is a useful diagnostic tool for spermatogenic impairment detection or if a somatic mosaicism between blood and testis in within the testis itself exists.
For this purpose, we were not only examining CAG repeat in blood lymphocyte DNA, but also in different cell populations of the testis on DNA and mRNA level. Single cell populations were assessed separately by applying laser assisted cell picking (LACP) technique and examined independently from each other. We used two different methods for CAG length determination, fragment length analysis as standard method on the one, and additionally native polyacrylamide gel electrophoresis on the other hand.
We were able to show the following results:
a) all assessed CAG repeats were within the physiological range
b) there is no correlation between CAG repeat length and histologically assessed status of spermatogenesis
c) the AR expression is independent of CAG repeat length and impairment of spermatogenesis
d) the ABP expression is significantly down regulated in patients with severely impaired spermatogenesis but independent of CAG repeat length
e) determination of CAG repeat length within the physiological range is susceptible for polymerase failure due to the formation of secondary DNA structures
f) patients showing a mixed atrophy of spermatogenesis show CAG length differences in Sertoli cell populations originating from tubules showing normal or impaired spermatogenesis
Defects of replication and transcription machinery may be caused by H+ bondings between the bases Guanin and Cytosin, which develop easily and are known to stop replication processes in bacteria and yeast.
Further experiments in this working group have to elucidate, whether even CAG repeats within the physiological range can influence gene expression of AR target genes and if an ideal CAG repeat length for AR function exists.
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