Entwicklung eines humanisierten Mausmodells für X-chromosomale Retinitis Pigmentosa, hervorgerufen durch eine Punktmutation im Rpgr Gen
Development of a humanized Mouse-Model for X-linked Retinitis Pigmentosa caused by a point mutation in the Rpgr gene
Schlegel, Jutta
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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-85658
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2012/8565/
Universität
Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut:
Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
Fachgebiet:
Biologie
DDC-Sachgruppe:
Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart:
Dissertation
Sprache:
Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung:
08.12.2011
Erstellungsjahr:
2011
Publikationsdatum:
10.01.2012
Kurzfassung auf Deutsch:
Mutationen im Gen des Retinitis Pigmentosa GTPase Regulators (RPGR)
stellen die häufigste Ursache für X-chromosomale Retinitis Pigmenotsa (RP)
dar. Die meisten der verantwortlichen Mutationen treten in einer spezifischen
repetitiven Region des terminalen Exons ORF15 auf, die deshalb
als mutation hot spot bezeichnet wird. Punktmutationen im ORF15 verursachen
Leserasterverschiebungen, die zu einer veränderten C-terminalen
Aminosäure-Kette mit möglichen toxischen Effekten führen. In dieser Arbeit
wurde ein Mausmodell entwickelt, bei dem die Deletion eines Basenpaares
zu einer Aminosäureveränderung führt, die der des menschlichen
mutierten Proteins gleicht.
Die pathologische Mutation und weitere stille Mutationen wurden mittels
homologer Rekombination eines Vektorkonstrukts in murine ES Zellen eingeführt.
Die Genotypisierung der ES Zellen und später der Tiere wurde
mittels PCR, RT-PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung durchgeführt.
Für histologische Untersuchungen wurden Paraffin- sowie Semidünnschnitte
und elektronen-mikroskopische Aufnahmen angefertigt.
Der Targeting-Vektor wurde in C57/BL6-129sv hybrid ES Zellen eingeführt
und die positiven Klone in Blastozysten implantiert. Die Chimären wurden
genotypisiert und in einen BL/6J Hintergrund zurückgekreuzt. Histologische
Untersuchungen der Retinae deuten auf eine fortschreitende Reduktion
der Retinadicke hin, außerdem finden sich delokalisierte Nuclei in der
Schicht der Inneren Segmente und eine Auflösung der Membrana Limitans
Externa. Ab einem Alter von 6 Wochen sind umfassende morphologische
Veränderungen der Photorezeptorzellen zu beobachten.
Das neu erzeugte Mausmodell bildet einen degenerativen Phänotyp aus,
was auf die Aktivierung eines ähnlichen oder verwandten pathologischen
Verlaufs, verglichen mit dem beim Menschen, hindeutet. Dieses Model wird
zukünftig Einblicke in die pathologischen Mechanismen gewähren, die an
der retinalen Degeneration beteiligt sind, ebenso wie in die biochemischen
Gründe für die Toxizität der veränderten Proteine. Es soll jedoch zukünftig
auch als Therapiemodell dienen, weshalb eine Erkennungssequenz für die
Homingendonuklease I-SceI integriert wurde, um eine spätere Sequenzreparatur
mittels homologer Rekombination an den Chromosomen der Photorezeptoren
durchführen zu können.
Kurzfassung auf Englisch:
Mutations in the gene encoding the retinitis pigmentosa GTPase regulator
(RPGR) are known to be the dominant cause for X-linked RP in humans.
Most of the responsible mutations can be found in a specific, repetitive
region of the ORF15, which is therefore called the mutation hot spot of
RPGR. There, point mutations are responsible for a frame shift, causing the
C-terminal amino acid chain to be modified while potentially causing a toxic
gain of function of the mutated protein.
The purpose of this work was to develop a mouse model that contains a
1–base pair deletion, provoking the change of the amino acids at the Cterminal
end of the mouse protein to be similar to the one in mutated human
proteins. The pathological mutation along with additional, silent mutations
where introduced into murine ES cells using homologous recombination of
a targeting vector. The genotyping of the ES cells as well as the animals was
performed using PCR, RT-PCR, restriction-digestion and sequencing. In order
to perform the required histological analysis, paraffin sections, semithin
sections and electron microscopic images where produced.
The targeting vector was introduced into C57/BL6-129sv hybrid ES cells
and positive clones were implanted into surrogate mother mice. Chimeric
animals were genotyped and back-crossed into a BL/6J background. Histological
analysis of the retina at different ages of the mice revealed a progressive
reduction of the retina thickness as well as delocalized nuclei among
the IS (inner segments) and a disruption of the Outer Limiting Membrane.
Beginning at an age of six weeks, severe morphological changes can be observed
in the photoreceptors.
The mouse model generated in the course of this work shows pathologies
suggesting a disease-progression similar to the one found in human patients.
In the future this model will allow us to gain insight into the pathological
mechanisms responsible for the degeneration as well as the biochemical
triggers for the toxicity of the mutated proteins. Furthermore, it is designed
to be a model for therapeutic approaches since it contains an I-SceI
homingendonuclease recognition site for later sequence repair by homologous
recombination.
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