Giessener Elektronische Bibliothek

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Untersuchungen zur Funktion von Caveolinen in den unteren Atemwegen

Schlenz, Heike


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.299 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-84598
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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5836-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 08.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Der bedeutendste neurogene Bronchokonstriktor ist Azetylcholin. Es wird von
parasympathischen Nervenfasern ausgeschüttet und wirkt über die muskarinergen
Rezeptorsubtypen M2R und M3R auf die glatten Muskelzellen der Atemwege
während die Azetylcholin-Ausschüttung gleichzeitig über den präsynaptischen M2R
gehemmt wird. Ein weiterer bronchokonstriktorischer Neurotransmitter ist Serotonin
(5-HT), das im Rahmen von allergischen und entzündlichen Reaktionen zusätzlich
von Mastzellen, Thrombozyten und neuroendokrinen Zellen des Respirationstrakts
freigesetzt wird. Aus der Muskulatur von Herz und Harnblase und verschiedenen
anderen Zelltypen sind strukturelle bzw. funktionelle Verbindungen sowohl der
muskarinergen als auch der serotoninergen Rezeptoren mit Caveolin-1 und -3
(Cav-1, Cav-3), den Strukturproteinen der Caveolae, bekannt. Caveolae sind
cholesterolreiche, Ω-förmige Einstülpungen der Plasmamembran. Innerhalb der
Caveolae befinden sich neben G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, darunter
Muskarin- und 5-HT-Rezeptoren, auch Ansammlungen verschiedener sekundärer
Signalmoleküle, die an der Regulation des Ca2+-Haushalts und der Kontraktilität der
Atemwegsmuskulatur beteiligt sind. In Anbetracht dessen wurde untersucht, ob die
cholinerge und serotoninerge Bronchokonstriktion an Caveolae gekoppelt ist und den
Caveolinen eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Atemwegskonstriktion
zukommt.
Um dieser Frage nachzugehen, wurde zunächst das Vorkommen von Cav-1 in der
Atemwegsmuskulatur intrapulmonaler Bronchien der Maus auf mRNA-Ebene mittels
laserassistierter Mikrodissektion mit anschließender RT-PCR-Analyse und auf
Proteinebene mittels Western Blot und Immunhistochemie in Atemwegen der Maus
und des Menschen bestätigt und erstmals das Vorkommen von Cav-3 aufgezeigt.
Für die nähere Bestimmung der molekularen Zusammensetzung der Caveolae
wurden die Protein-Protein-Assoziationen von Cav-1, Cav-3 und M2R in situ in
murinen Gewebeschnitten mittels indirekter Doppelimmunhistochemie kombiniert mit
FRET-CLSM-Analyse untersucht. In der Bronchialmuskulatur wurde so eine
Assoziation von Cav-1 und Cav-3 nachgewiesen. Darüber hinaus wurden für Cav-1
und Cav-3 im Western Blot homo- und heterooligomere Komplexe detektiert, die für
die Ausbildung von Caveolae essenziell sind. Elektronenmikroskopische
Untersuchungen zum Vorkommen von Caveolae in der Bronchialmuskulatur von
Wildtyp- und Cav-1-defizienten Mäusen zeigten außerdem eine verringerte Anzahl
an Caveolae in Cav-1-defizienten Mäusen. Demnach sind sowohl Cav-1 als auch
Cav-3 in der Bronchialmuskulatur an der Bildung von Caveolae beteiligt, wobei Cav-1
höchstwahrscheinlich eine größere Rolle zukommt.
Die funktionelle Bedeutung der Caveolae/Caveoline für die Bronchokonstriktion
wurde in lebenden Lungenschnitten von Wildtyp-, M2R-, M3R- und Cav-1-defizienten
Mäusen vor und nach Zerstörung der Caveolae durch Cholesterolextraktion
aufgeklärt. Mittels Elektronenmikroskopie wurde die Effizienz des Cholesterolentzugs
bestätigt. Intakte Caveolae waren für die M2R- und M3R-vermittelte
Bronchokonstriktion essenziell. Interessanterweise zeigten Cav-1-defiziente Mäuse
im Vergleich zum Wildtyp eine unveränderte Reaktion. Dies deutet auf eine
funktionelle Kopplung der muskarinergen Bronchokonstriktion an Cav-3 hin. Dies
unterstützend wurde in der Bronchialmuskulatur mittels FRET-CLSM-Analyse eine
Assoziation des M2R mit Cav-3 detektiert, nicht jedoch mit Cav-1. In Anbetracht der
Abhängigkeit der muskarinergen Bronchokonstriktion von intakten Caveolae
erscheint eine Verankerung des M2R in den Caveolae mittels Cav-3 für die
Initiierung der M2R-vermittelten Bronchokonstriktion essenziell. Der endgültige
Beweis muss in nachfolgenden Studien an Cav-3-defizienten Mäusen erbracht
werden.
Weiterhin wurde eine Cav-1-Abhängigkeit der serotoninergen Bronchokonstriktion
nur bei maximaler Stimulation durch 5-HT festgestellt. Dies deutet auf eine
Beteiligung mehrerer Subtypen von 5HT-Rezeptoren mit unterschiedlicher Cav-1-
Abhängigkeit hin.
Die hier gewonnenen Erkenntnisse, dass die Muskarin- und 5-HT-Rezeptoren in den
Glattmuskelzellen der Atemwege an Caveolae/Caveoline gekoppelt sind, bieten eine
Grundlage für mögliche pharmakologische Ansätze für die Behandlung obstruktiver
Atemwegserkrankungen wie COPD und Asthma. Dabei auf Cav-1-abhängige
Signalwege abzuzielen, würde die allergische serotoninerge, nicht aber die
cholinerge Bronchokonstriktion direkt beeinflussen.
Kurzfassung auf Englisch: Acetylcholine is the most important neurogenic bronchoconstrictor. It is released by
parasympathetic neurons and acts on airway smooth muscle cells via muscarinic
receptor subtypes M2R and M3R. At the same time further acetylcholine release is
inhibited via presynaptic M2R. Another neurotransmitter that induces
bronchoconstriction is serotonin (5-HT). During allergic and inflammatory processes it
is also released by mast cells, platelets and neuroendocrine cells of the respiratory
tract. In various cell types, including cardiac myocytes and urinary bladder smooth
muscle cells, muscarine and 5-HT receptors are linked to caveolin-1 and -3 (cav-1,
cav-3), the structural proteins of caveolae. Caveolae are cholesterol-rich, Ω-shaped
invaginations of the plasma membrane. They provide a scaffold for multiple G-protein
receptors, including muscarine and 5-HT receptors, and signalling molecules
involved in Ca2+-homeostasis and contractility of airway smooth muscle cells. Hence,
we hypothesized that cholinergic and serotonergic bronchoconstriction are coupled to
caveolae with caveolins playing a key role in the regulation of airway constriction.
To address this issue we confirmed the presence of cav-1 in murine intrapulmonary
bronchial smooth muscle on mRNA-level by laser-assisted microdissection with
subsequent RT-PCR-analysis and on protein level by Western Blot analysis and
immunohistochemistry in murine and human airways, and identified cav-3 as a novel
caveolar protein here. For further investigation of the molecular composition of
caveolae protein-protein associations between cav-1, cav-3 and M2R were
determined in situ by FRET-CLSM-analysis in immunolabeled murine lung sections.
Thereby, an association between cav-1 and cav-3 was discovered in bronchial
smooth muscle. Furthermore, caveolin homo- and heterooligomeric complexes that
are essential for the formation of caveolae were detected in Western Blot. Moreover,
a decrease in the number of caveolae was found in bronchial smooth muscle from
cav-1-deficient mice in comparison to wildtype mice by electron microscopy,
demonstrating the involvement of both caveolin isoforms in caveolae formation with
cav-1 probably playing the major role.
The functional impact of caveolae/caveolins for bronchoconstriction was elucidated
by recording bronchial constriction responses in living lung slice preparations from
wildtype, M2R-, M3R- and cav-1-deficient mice before and after caveolae disruption
by cholesterol extraction. Electron microscopy was used to validate the efficiency of
cholesterol extraction. Functionally, M2R- and M3R-mediated bronchoconstriction
were dependent on intact caveolae. Interestingly, cav-1-deficient mice showed an
unchanged response compared to wildtype mice, pointing to a functional coupling of
muscarinic bronchoconstriction to cav-3. In line with this, FRET-CLSM-analysis
revealed an association of the M2R with cav-3, but not with cav-1. Considering the
dependency of muscarinic bronchoconstriction on intact caveolae one can assume
that an anchorage of M2R in caveolae via cav-3 might be essential for the initiation of
M2R-mediated bronchoconstriction. However, further functional studies with cav-3-
deficient mice are necessary to prove this.
Besides, a cav-1 dependency of serotonergic bronchoconstriction was detected only
at maximal stimulation by 5-HT, suggesting an involvement of various 5-HT receptor
subtypes with different cav-1 dependencies.
Regarding the coupling of muscarine and 5-HT receptors to caveolae/caveolins in
airway smooth muscle these findings provide novel basic knowledge that might be
valuable for pharmacological targeting and treatment of obstructive airway diseases
like COPD and asthma. Addressing cav-1-dependent signalling pathways may target
allergic serotonin-induced but not cholinergic bronchoconstriction.
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