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Einfluss des Calcium-aktivierten Kaliumkanals auf die Lysophosphatidylcholin induzierte Monozytenadhäsion an humanen Endothelzellen

Hartmann, Marc


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.345 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-84497
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8449/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Innere Medizin
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5806-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 29.11.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob die Lysophosphatidylcholin
(LPC) induzierte Aktivierung des BKCa an der Monozytenadhäsion von U937-Zellen
an humanen Nabelschnur Endothelzellen (HUVEC) beteiligt ist.
Dabei wurde der Einfluss des BKCa auf das Membranpotential mit dem
Fluoreszenzfarbstoff DiBAC gemessen. Die calcium- und radikalabhängige Adhäsion
wurde mit Hilfe des 3[H]-Thymidin-Adhäsions-Assays untersucht. Die calcium- und
radikalabhängige Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM wurde mit
Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen.
LPC induzierte eine konzentrationsabhängige Hyperpolarisation von HUVEC mit
einem Maximum bei 20 myM. Weitere Konzentrationserhöhungen zeigten hierbei
keinen steigernden Effekt. Deshalb wurden alle weiteren Versuche mit einer
Konzentration von 20 myM durchgeführt. Der hoch spezifische BKCa-Inhibitor
Iberiotoxin (IBX) konnte die Hyperpolarisation verhindern (IBX, 100 nM). Dies deutet
darauf hin, dass dieser Ionenkanal für die Hyperpolarisation der Zellmembran
verantwortlich ist.
Es konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion von unstimulierten U937-Zellen durch
Stimulation der HUVEC mit LPC verstärkt werden konnte. Dieser Effekt war zeitlich
abhängig und nach t=4 Stunden gegenüber der Kontrolle signifikant. Die Stimulation
von U937-Zellen führte nicht zu einer Steigerung der Adhäsion an unstimulierten
HUVEC. Dies deutet darauf hin, dass die Adhäsion hauptsächlich von endothelialer
Seite auszugehen scheint. Die LPC induzierte Adhäsion konnte signifikant verringert
werden, wenn die HUVEC mit IBX, beziehungsweise dem NADPH-Oxidase-Inhibitor
Diphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) koinkubiert wurden. Ebenfalls verringerte die
Hemmung der intrazellulären Calciumkonzentration durch den Calciumkanalblocker
2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) sowie den Calciumchelator BAPTA
(10 myM) die LPC induzierte Adhäsion signifikant. In den FACS-Versuchen konnte
LPC die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM signifikant steigern.
Durch Zugabe von IBX, DPI und BAPTA wurde die Expression von ICAM und VCAM
ebenfalls signifikant verringert.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die zeitabhängige Adhäsion sowie die
Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM von der intrazellulären
Calcium- und Radikalkonzentration abhängig sind und diese vom BKCa reguliert
werden.
Kurzfassung auf Englisch: Aim of this study was to investigate whether LPC-induced activation of BKCa is also
involved in monocyte adhesion of U937-cells to human umbilical cord endothelial
cells (HUVEC). Therefore the influence of BKCa to membrane potential was
measured with DiBAC-fluorencence-dye. The calcium and ROS-dependent adhesion
was examined by using the 3[H]-thymidine-adhesion-assay. The calcium and ROSdependent
expression of adhesion molecules ICAM and VCAM was analysed with
flow-cytometry.
LPC induced a hyperpolarization of HUVEC in a dose-dependent manner with the
maximum of 20 myM. Higher doses of LPC did not further enhance hyperpolarization.
For this reason all following experiments were performed using a concentration of 20
myM. The highly specific BKCa-inhibitor Iberiotoxin (IBX) prevented hyperpolarisation
(IBX, 100 nM). This indicates that this ion channel is responsible for
the hyperpolarization of the cellmembrane.
Adhesion of untreated U937 cells to HUVEC was increased after stimulation of
HUVEC with LPC. This effect was time-dependent with a maximum observed after
t=4 hours. On the other hand, stimulation of U937 cells with LPC did not cause
enhancement of adhesion to unstimulated HUVEC. This indicates that the process of
adhesion is mainly caused by endothelial cells. LPC-induced adhesion was
significantly reduced when HUVEC were co-incubated with IBX, NADPH-oxidase
inhibitor diphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) or by addition of calcium channel-blocker
2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) or the calcium-chelator BAPTA (10
myM) to reduce intracellular calcium concentration.
In FACS analyses LPC enhanced the expression of adhesion molecules ICAM and
VCAM. In Addition to LPC IBX, DPI and BAPTA significantly decreased ICAM and
VCAM expression.
In conclusion the experiments demonstrate that time-dependent adhesion as well as
the expression of adhesion molecules ICAM and VCAM depends on intracellular
concentration of calcium and reactive oxygen species which are regulated by BKCa.
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