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Involvement of connexin 43 in ATP release from endothelial cells during reoxygenation : Role of PKA signaling pathway

Khawaja, Kiran


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.986 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-84083
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8408/

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Universität Justus-Liebig-Universit酹 Gie絽n
Institut: Institute of Physiology
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5824-1
Sprache: Englisch
Tag der mndlichen Prfung: 26.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 09.11.2011
Kurzfassung auf Englisch: Reperfusion-injury impairs endothelial barrier function and may lead to edema formation, impeding recovery of the reperfused heart. Recently is has been shown that ATP, spontaneously released from endothelial cells (EC) during reperfusion protects the endothelial barrier against reperfusion-injury. The aim of the present study was to identify the mechanism of this spontanous ATP release during reoxygenation in endothelia cells. The central hypothesis is that EC release ATP via a connexin-mediated route. It is shown that macrovascular endothelial cells from porcine (PAEC) release ATP via Cx43 hemichannels at the onset of reperfusion. Determination of LDH activity in the culture medium rouled out that the increase in ATP is due to release from lysed cells. Pharmacological inhibitors of connexin function, i.e., mefloquine at concentrations above 10 然, 200 然 La3+, 50 然 18-α glycyrrhetinic acid or 50 然 flufenamic acid reduced reperfusion-induced ATP release. In contrast, maneuvers, which inhibit pannexins, like probenecid at concentrations between 10 然 to 1 mM or mefloquine at concentrations below 10 然, did not affect ATP under the same conditions, indicating that ATP release is mediated via connexins rather than pannexins. These results were confirmed by using a specific Cx43-siRNA transfection strategy. The addition of the connexin hemichannel openers i.e anti-arrythmic peptide 10 (AAP10, 10 然) or alendronate (10 然) significantly increased ATP-release compared to the reoxygenated control. Reoxygenation-induced ATP release was also enhanced when a specific PKA-activator like 8-BrcAMP (1 然), and Sp8CPT (10 然) was added with the onset of reperfusion, while H-89 (20 然), KT-5720 (100 nM) as well as two specific protein kinase inhibitor peptides 6-22-amide (100 nM) or 14-22-amide (5 然) abrogated the effect. In line with that, Cx43 phosphorylation was reduced by PKA inhibitors and increased by activators, indicating that PKA mediated signaling mechanisms are involved in Cx43-mediated ATP release under these conditions.
Conclusion: The present study demonstrates that endothelial cells release ATP in a Cx43-dependent process during reoxygenation. Reoxygenation stimulated the cAMP/PKA signaling pathway which targets Cx43 at Ser 368 triggering the ATP release via Cx43. This reoxygenation-induced ATP release is enhanced by two chemically not related connexin channel openers also targeting the cAMP/PKA pathway. Strengthening of this endogenous mechanism by direct activation of cAMP/PKA pathway and temporary opening of Cx43 hemichannels could represent a new therapeutic strategy to prevent acute e
ndothelial barrier failure during reperfusion-injury.
Kurzfassung auf Deutsch: Reperfusionsch輐en st顤en die endotheliale Schrankenfunktion und k霵nen zur Entstehung von 猘emen fhren. Hierdurch wird die Regeneration des reperfundierten Herzen beeintr踄htigt. Wie krzlich gezeigt wurde, schtzt ATP, das spontan von Endothelzellen (EC) w鄣rend der Reperfusion abgegeben wird, die endotheliale Schranke vor Reperfusionssch輐en. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Mechanismus der spontanen ATP-Freisetzung in Endothelzellen zu untersuchen. Zentrale Hypothese war hierbei, dass Connexin 43 (Cx43) an der endothelialen ATP-Freisetzung w鄣rend der Reoxygenierung beteiligt sind. Es wurde beobachtet, dass die ATP Freisetzung in makrovaskul酺en EC des Schweines zu Beginn der Reperfusion Cx43-abh鄚gig ist. Messungen der LDH-Aktivit酹 ergaben, dass dieser Anstieg der ATP-Konzentration nicht auf Zelllyse zurckzufhren ist. Um den Mechanismus der ATP-Freisetzung zu untersuchen, wurden EC einerseits mit den selektiven Pannexin- und Connexininhibitoren wie Mefloquine (10然) und Lanthan-(III)-chlorid (200然), sowie andererseits mit den panspezifischen Inhibitoren wie 18α-Glycyrrhetinic acid (50 然) oder Flufenamic acid (50 然) vorinkubiert. Dies fhrte zu einer Reduktion der durch Reperfusion verursachten ATP-Freisetzung. Wurde dagegen Pannexin mittels Probenecid in einer Konzentration zwischen 1然 und 10然, oder Mefloquine in einer Konzentration kleiner als 10然 unter sonst gleichen Bedingungen gehemmt, fhrte dies nicht zu einer Reduktion der ATP-Freisetzung. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die ATP-Freisetzung eher durch Connexin als durch Pannexin erfolgt.
Diese Ergebnisse konnten durch eine spezifische Cx43-siRNA-Transfektionsstrategie best酹igt werden. Der Zusatz des anti-arrythmischem Peptids 10 (AAP10; 10然) oder Alendronat (10然), die Connexinkan鄟e 鐪fnen, fhrte zu einer signifikanten Steigerung der ATP-Freisetzung im Vergleich zur reoxygenierten Kontrolle. Die durch Reoxygenierung induzierte ATP-Freisetzung wurde ebenfalls verst酺kt, wenn spezifische Aktivatoren der PKA, wie 8-BrcAMP (1 然), Sp8CPT (10 然) und 6Bnz (10 然) zu Beginn der Reperfusion zugesetzt wurden. Dagegen trat dieser Effekt durch die Gabe von H-89 (20 然), bzw. KT-5720 (100 nM) sowie das PKA-inhibierende Peptid 6-22-amide (100 nM) oder 14-22-amide (5 然) nicht auf. Gleichzeitig dazu bewirken PKA-Inhibitoren eine Abnahme der Connexin43-Phosphorylierung, w鄣rend PKA-Aktivatoren diese verst酺ken, Das deutet darauf hin, dass PKA-vermittelte Signaltransduktionsmechanismen an der Cx43-vermittelten ATP-Freisetzung beteiligt sind.
Schlussfolgerung: Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass Schweineendothelzellen w鄣rend der Reoxygenierung ATP mittels Cx43 freisetzen. Die Reoxygenierung stimuliert auch den cAMP/PKA-Signalweg, wobei der Angriffspunkt der Phosphorylierung das Serin an Position 368 von Connexin 43 ist. Durch Ver鄚derungen an dieser Stelle wird die ATP-Freisetzung gesteuert. Die durch Reoxygenation verursachte ATP-Freisetzung wird durch zwei chemisch nicht verwandte Connexin-Kanal鐪fner verst酺kt, welche beide auf den cAMP/PKA-Signalweg einwirken. Eine Verst酺kung dieses endogenen Mechanismus durch direkte Aktivierung des cAMP/PKA-Signalweges und damit eine zeitlich begrenzte 猈fnung des Connexin-Kanals k霵nte eine neue therapeutische Strategie sein, die akute endotheliale Schrankenst顤ung w鄣rend der Reperfusion zu verhindern.

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