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Autoimmunity in complex regional pain syndrome

Kohr, Danielle


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-83879
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8387/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Department of Neurology
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5825-8
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 09.11.2011
Kurzfassung auf Englisch: Complex regional pain syndrome (CRPS) is a painful condition affecting one or
more extremities of the body, marked by a wide variety of symptoms and sings that
are often difficult to manage since pathophysiology is incompletely understood.
Thus, diverse treatments might be ineffective. A recent report revealed the
presence of autoantibodies against nervous system structures in CRPS patients.
However it remained unclear how the antibodies act in the development of CRPS.
We therefore aimed to characterize these antibodies and identify target antigens.
Sera of CRPS patients, neuropathy patients and healthy volunteers were tested for
surface-binding autoantibodies to primary cultures of autonomic neurons and many
differentiated neuroblastoma cell lines using flow cytometry. Further, functional
properties of affinity-purified IgG of controls or CRPS patients were assessed using
a cardiomyocyte bioassay. Putative receptors and target antigens were identified
using antagonistic drugs and synthesized peptides sequences corresponding to
segments of these receptors. Peptides were also used to establish an enzyme
immunoassay. Antibodies were tested in stable transfected CHO cells with putative
receptors to ensure observed binding. Further, changes in the intracellular Ca2+
concentration induced by agonistic IgG were measured using the Ca2+-sensitive
fluorescent dye fura-2 assay. Potential cytotoxicity of binding antibodies were
tested using LDH and WST-1 assay.
13/30 CRPS patients, but none of 30 healthy controls and only one out of 20
neuropathy sera had specific surface-binding to autonomic neurons. The majority
of the sera reacted with both sympathetic and myenteric plexus neurons. The
differentiation of SH-SY5Y into a cholinergic phenotype induced a surface-antigen,
which is recognized by 60% of CRPS sera (18/30), but not by controls. Moreover,
ELISA and an established cardiomyocyte assay demonstrated the presence of
autoantibodies in most CRPS patients with agonistic-like properties on the β2AR
and M2R. We identified these autoantibodies as immunoglobulin G directed
against peptide sequences from the second extracellular loop of these receptors.
Though antibodies acted on receptors and increase in intracellular Ca2+
concentration in transfected cells, they were not able to induce receptor
downregulation, desensitization or cytotoxicity.
The recent detection of functionally active autoantibodies in serum samples from
CRPS patients against cell-surface determinants of sympathetic, myenteric and
differentiated autonomic nervous system neurons, and the identification of these
determinants as part of β2AR or M2R expressed in these cells suggested an
autoimmune mechanisms as one important pathogenic factor in the
pathophysiology of CRPS. Thus, our findings contribute to the understanding of
this disease, could help in the diagnosis in future, and encourage new treatment
strategies focusing on the immune system.
Kurzfassung auf Deutsch: Das komplexe regionale Schmerzsyndrom gehort zur Gruppe der chronisch
posttraumatischen Schmerzsyndromen. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch
regionale, persistierende neuropathische Schmerzen mit sensorischen-, vaso-,
sudomotorischen-, motorischen- und trophischen Veranderungen nach auserer
Einwirkung (z. B. Traumen, Operationen und Entzundungen). Da der
zugrundeliegende Pathomechanismus des CRPS noch nicht eindeutig geklart ist,
sind die Symptomenkomplexe therapeutisch nur symptomatisch beeinflussbar.
Unserer Gruppe gelang erstmals der Nachweis von Autoantikorpern gegen
Strukturen des autonomen Nervensystems bei Patienten mit CRPS. Bis heute
wurde jedoch noch nicht untersucht, in wie weit diese Antikorper eine Rolle bei der
Entstehung des CRPS spielen konnten. Das Ziel der vorliegend Arbeit war die
Charakterisierung dieser Antikorper, sowie die Identifizierung der zugehorigen
Antigene.
In der hier vorgestellten Studie untersuchten wir Seren von gesunden Probanden,
CRPS- und Polyneuropathie-Patienten auf das Vorliegen relevanter Autoantikorper
gegen Oberflachenepitopen primarkultivierter autonomer Neuronen und
differenzierter Neuroblastom-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Daruber hinaus
untersuchten wir mogliche funktionelle Effekte antineuronaler Autoantikorper im
Bioassay der spontan pulsierenden neonatalen Rattenherzmuskelzellen. Zur
Identifizierung der Bindungsrezeptoren bzw. Bindungsepitops untersuchten wir den
Effekt von Rezeptoren-Antagonisten und von kurzen uberlappenden Peptiden der
extrazellularen Schleife verschiedener Rezeptoren. Diese Peptide der
extrazellularen Schleife autonomer Rezeptoren wurden zur Etablierung eines
ELISA-Assay verwendet. Zur Bestatigung der Bindungseigenschaften der
Autoantikorper wurden stabil transfizierte CHO-Zellen mit Bindungsrezeptoren
durch Anwendung der Durchflusszytometrie und Imaging-(Fura-2)-Technik
getestet.
Bei 13/30 CRPS-Patienten aber nur bei 1/20 Patienten mit Polyneuropathie und
bei keiner Kontrolle konnte die Bindung von IgG an der Oberflache
primarkultivierter autonomer Neuronen durchflusszytometrisch nachgewiesen
werden. Die meisten Seren reagierten sowohl mit Neuronen aus sympathischen
Ganglien, wie auch kultivierten Darmplexusneuronen. 18/30 der CRPS- aber keine
Kontroll-Seren erkannten eine Epitop erzeugt durch Differenzierung von SY5Y zum
cholinergischen Phanotyp. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Mehrheit der
CRPS-Patienten stimulierende Antikorper gegen ƒÀ2AR und M2R aufweisen. Der
Nachweis der Autoantikorper erfolgte mittels ihres chronotropen Effekts auf die
Pulsationsrate der Herzmuskelzellen sowie dessen Blockierung durch den
adrenergen ƒÀ2-Blocker, den M2-Antagonist und synthetische gegen die 2.
extrazellulare Schleife der beiden Rezeptoren gerichtete Peptide. Diese Daten
wurden durch erhohte Bindung patogenischer Antikorper zu der Oberflache ƒÀ2AR
und M2R transfizierter Zellen bestatigt. Obwohl durch die Imaging-(Fura-2)-
Technik der stimulierende Antikorpereffekt wieder bestatigt wurde, fuhrte keine
untersuchte IgG-Fraktionen von CRPS-Patienten zu zellbiologischen
Veranderungen wie Zytotoxizitat oder Rezeptor-Desensitisierung bzw. -
Downregulation.
Die von uns nachgewiesenen funktionellen Effekte antineuronaler Autoantikorper
von CRPS-Patienten gegen primarkultivierter und differenziert autonomer
Neuronen und der Charakterisierung stimulierender Autoantikorper gegen
Peptiden der zweiten extrazellularen Schleife der ƒÀ2AR und M2R deutet darauf
hin, dass Immunmechanismen in der Pathogenese des CRPS, moglicherweise
durch eine Autoimmunreaktion gegen das autonome Nervensystem eine wichtige
Rolle spielen konnten. Unsere Erkenntnisse bieten einen Einblick in mogliche
pathophysiologische Mechanismen bei der Entstehung von CRPS. Sie konnten als
Basis fur neue Uberlegungen uber diagnostische Methoden und den Einsatz
immunmodulierender Therapiestrategien dienen.
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