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Charakterisierung der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest

Lamp, Benjamin Jakob Joachim


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.426 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-83812
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8381/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5822-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 01.11.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Die Biosynthese der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest
(KSPV) wurde hinsichtlich der Hierarchie und Dynamik der proteolytischen Reifung
charakterisiert. Dabei wurden ein wildtypisches nicht-zytopathogenes Feldvirus sowie
zwei zytopathogene Konstrukte untersucht, um einen Bezug zu beschriebenen Daten vom
nahe verwandten BVDV zu ermöglichen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Ein GST-NS2-3 Fusionsprotein, ein C-terminales Fragment der NS3-Helikase, ein
C-terminales Fragment von NS4B und das vollständige NS5A des KSPV wurden
in E. coli exprimiert und mittels Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie gereinigt.
Nach Immunisierung von Versuchstieren erfolgte die Herstellung und
Charakterisierung monoklonale Antikörper (mAbs) gegen diese Proteine.
2. Indirekte Immunfluoreszenz-Analysen zeigten eine enge Assoziation aller KSPV
Nichtstrukturproteine mit den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. In
Immunoblotanalysen eines zp KSPV Replikons und des nzp KSPV konnten die
Vorläufermoleküle NS4-5 und NS2-3, die Prozessierungsintermediate NS5A/B,
NS4B-5A und NS4A/B zusammen mit den reifen Nichtstrukturproteinen
identifiziert werden. Außerdem zeigte sich eine zusätzliche interne Prozessierung
des reifen NS3 zwischen der Protease- und Helikasedomäne des Moleküls.
3. In nzp KSPV, zp KSPV-JIV und dem zp KSPV Replikon wurde die Prozessierung
der Nichtstrukturproteine mittel Immunpräzipitation und „pulse chase“ Analysen
dargestellt. Während der zp Biotyp des KSPV eine effiziente Generierung aller
Nichtstrukturproteine zeigt, erfolgt die Reifung dieser Proteine im nzp Biotyp nur
sehr langsam. Zum Vergleich der Biotypen wurden die Halbwertszeiten der
Vorläufermoleküle und reifen Produkte bestimmt. In diesen Analysen erwiesen
sich die reifen Proteine des KSPV als stabil (T1/2: 1,5-4 h). Im zp Biotyp werden
die Vorläufermoleküle schneller umgesetzt (T1/2: 0,5-2,5 h) als die reifen
Nichtstrukturproteine abgebaut werden, so dass die reifen Proteine in den Zellen
akkumulieren. Dagegen erzeugt die langsame Reifung der Vorläufermoleküle im
nzp Biotyp (T1/2: 2,5-5,5 h) eine konstante Menge an reifen Nichtstrukturproteinen
in den infizierten Zellen. Diese Daten deuten erstmals darauf hin, dass die
gesteigerte Expression von NS3 im zp Biotyp eines Pestivirus die Prozessierung
der anderen Nichtstrukturproteine beschleunigt. Umgekehrt beschränkt die
verminderte NS2-3 Spaltung in nzp Pestiviren die Aktivität der NS3 Protease und
reguliert so die Konzentration der reifen Nichtstrukturproteine.
Kurzfassung auf Englisch: The biosynthesis of Classical swine fever virus (CSFV) nonstructural proteins was
characterized with regard to hierarchy and dynamics of proteolytic maturation. A wildtypic
non-cytopathogenic isolate and two cytopathogenic CSFV constructs were analysed to allow
the comparison with data about the closely related BVDV. The following results were
achieved:
1 A GST-NS2-3 fusion protein, a C-terminal fragment of the NS3 helicase, a Cterminal
fragment of NS4B, and the entire NS5A of CSFV were expressed in E.
coli und purified by Ni2+ ion affinity chromatography. Following the immunization
of laboratory animals, monoclonal antibodies (mAbs) against these proteins were
produced and characterized.
2 Indirect immunofluorescence experiments showed a tight association of all CSFV
nonstructural proteins with membranes of the endoplasmic reticulum. Immunoblot
analyses of a cp CSFV replicon and ncp CSFV led to the identification of NS4-5
and NS2-3 precursors, NS5A/B and NS4A/B processing intermediates, and of all
mature nonstructural proteins. In addition, a novel internal processing of NS3 was
detected separating the protease and helicase domains of this molecule.
3 The nonstructural protein processing of ncp CSFV, cp CSFV-JIV, and a cp CSFV
replicon was characterized by immunoprecipitation together with pulse chase
analyses. The nonstructural protein maturation of the ncp biotype of CSFV occurs
very slowly, while an efficient generation of all nonstructural proteins takes place
in the cp biotype. Half-lives of precursors and mature proteins were determined to
directly compare the different biotypes. These analyses showed that the mature
nonstructural proteins of CSFV are stable (T1/2: 1,5-4 h). The maturation of
precursor molecules was faster (T1/2: 0,5-2,5 h) than the turnover of mature
products in the cp biotype. In contrast, a constant amount of mature proteins results
from a slow maturation of precursor molecules in the ncp biotype (T1/2: 2,5-5,5 h).
These data indicate that enhanced expression of NS3 in cp pestiviruses is
responsible for an accelerated processing of the other nonstructural proteins. In
contrast, inefficient NS2-3 cleavage in ncp pestiviruses restricts NS3 protease
activity and thereby regulates the concentration of all mature nonstructural
proteins.
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