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Antigenität des FcgammaIIIb-Rezeptors : Immunologische und funktionelle Charakterisierung

Naumann, Carmen (geborene Bauer)


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-83377
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8337/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für klinische Immunologie und Transfusionsmedizin
Fachgebiet: Medizin fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.08.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 05.09.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Epitopbildung und IgG-Bindung von HNA-1a und HNA-1b
Speziell erstmals in der Literatur erwähnt ist das Antigen HNA-1a 1960, es fand sich im Rahmen eines Granulozytenagglutinationstests im Serum eines Patienten mit NIN. Es war somit das erste granulozytenspezifische Antigen, das beschrieben wurde. 14 Jahre später wurde das dazugehörige antithetische Allel HNA-1b erstmals beschrieben. Beide Antigene finden sich auf CD16b auf neutrophilen Granulozyten und können ursächlich für Allo- und Autoantikörper sein. Die Epitopbildung dieser beiden Antigene steht im Mittelpunkt dieser Arbeit. Gesichert war bisher nur, dass sich HNA-1a und HNA-1b durch vier Aminosäurenaustausche an der distalen Domäne des FcRIIIb unterscheiden. Diese liegen an den Positionen 36 (Arginin/Serin), 65 (Asparagin/Serin), 82 (Asparaginsäure/ Asparagin) und 106 (Valin/Isoleucin). Welche der Austausche für den Epitopaufbau erforderlich sind, war bisher unbekannt. Zunächst wurden Expressionsvektoren für beide Antigene hergestellt. Anschließend wurden Mutationen an vier Positionen der jeweiligen Konstrukte durchgeführt und so alle denkbaren 14 Zwischenstufen der beiden Antigene hergestellt, sequenziert und in 293F-Zellen transfiziert. Um nun feststellen zu können, welche Aminosäuren die Epitope bilden, wurden die Zelllinien zunächst auf Expression und anschließend mit HNA-1a- und HNA-1b-spezifischen Antikörpern auf Reaktivität getestet. HNA-1a-reaktiv waren alle Varianten, die Asn65 und Asp82 trugen, HNA-1b-reaktiv waren alle Varianten, die Ser65 und Asn82 aufwiesen. Solche Varianten, die sowohl mit dem HNA-1a- und dem HNA-1b-spezifischen Antikörpern reagierten, wiesen Ser65 und Asp82 auf; Varianten, die an beiden Positionen Asparagin (Asn65 Asn82) aufwiesen, waren null-reaktiv. Die beiden randständigen Aminosäuren haben nach diesen Ergebnissen für den Epitopaufbau keine Bedeutung. Es lässt sich anhand dieser Ergebnisse folgern, dass das HNA-1a/-1b-Epitop des FcIIIb-Rezeptor von den beiden mittleren Aminosäuren kodiert wird. Weiter ist festzustellen, dass das Epitop von HNA-1a von den beiden Aminosäuren Asparagin und Asparaginsäure kodiert wird und das Epitop von HNA-1b von den beiden Aminosäuren Serin und Asparaginsäure kodiert wird. Da jedoch solche Varianten, die an Position 65 Serin trugen und an Position 82 Asparaginsäure eine Doppelreaktion zeigten, ist davon auszugehen, dass die Position 65 mit Serin verantwortlich für die Spezifität HNA-1b und die Position 82 mit Asparaginsäure verantwortlich für die Spezifität HNA-1a ist. Insbesondere die identifizierten „panreaktiven“ Formen stellen einen vielversprechenden Ausgangspunkt zur Verbesserung der serologischen Diagnostik, vor allem im Rahmen der Prävention der TRALI dar.
Bisher ungeklärt ist die funktionelle Bedeutung der beiden Isoformen HNA-1a und HNA-1b. Im IgG-Bindungstest konnte nachgewiesen werden, dass HNA-1b IgG geringfügig, aber nicht signifikant, besser bindet als HNA-1a; dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu publizierten Ergebnissen. Allerdings zeigen die funktionellen Untersuchungen, dass einige Varianten, insbesondere alle, die Ser65 Asp82 trugen, signifikant schlechter an IgG binden konnten, als die Isoform HNA-1a. Damit erscheint es weiterhin vorstellbar, dass der Allotyp die Funktion beeinträchtigt, jedoch bleibt offen, ob in vivo ein Unterschied in der Funktionsfähigkeit der Granulozyten vorliegt.

OND
Antikörper gegen Antigene auf der Membran von Neutrophilen können zum Teil zu schwerwiegenden Erkrankungen wie NIN oder TRALI führen. Zu den neutrophilen Alloantigenen gehört auch HNA-5a, das zu den β2-Integrinen zählt und sich auf Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten befindet. Antikörper gegen das Antigen sollen Autoimmunneutropenien auslösen und zur Abstoßung von Hauttransplantationen führen. β2-Integrine sind aufgrund ihres breiten Reaktionsspektrums schwer zu detektieren. Es wurde eine zuverlässige PCR-SSP-Methode mit sequenzspezifischen Primern entwickelt, mit der sich der HNA-5a-Genotyp zuverlässig ermitteln lässt. Getestet wurden 320 Individuen verschiedener Volkszugehörigkeiten: Europäer, Indios, Chinesen und Afrikaner. Die Antigenhäufigkeit betrug 0.659, 0.59, 0.646 und 0.64, sie war also in allen Populationen ähnlich. In allen Populationen fand sich auch das HNA-5a-negative Allel (HNA-5bW). Die Häufigkeit betrug 15,3%; dies weicht von früheren Studien, die auf Immunfluoreszenz-Assays basieren, deutlich ab. Dies unterstreicht die Wichtigkeit der Genotypisierung durch PCR-SSP.
Kurzfassung auf Englisch: Epitopes and IgG binding properties of HNA-1a and HNA-1b
HNA-1a is mentioned in literature for the first time in 1960, when it was described by granulocyte agglutination in the serum of a patient with neonatal alloimmune neutropenia. HNA-1a is therefore the first human neutrophil antigen (HNA). Only 14 years later, its corresponding allele, HNA-1b, was described. Both antigens reside on CD16b on neutrophils and are able to trigger the formation of allo- and autoantbodies.
Formation of the HNA-1a and -1b epitopes is in the focus of this thesis. It has long been known that HNA-1a and HNA-1b differ by four amino acid exchanges in the distal domain of FcgammaRIIIb: 36 (arginin/serin), 65 (asparagines/serin), 82 (aspartic acid/asparagines) and 106 (valines/isoleucines). If all or only some of these amino acids take part in epitope formation was unknown.
In my thesis, I produced all possible 16 isoforms that can be made by permutation of these 4 positions, by recombinant protein technology. After expressing these isoforms in 293F cells, there reactivity with monoclonal antibodies specific for HNA-1a and HNA-1b was tested, respectively.
Exclusive reaction with monoclonals specific for HNA-1a were seen with mutants carrying Asn65 and Asp82, whereas Ser65 and Asn82 mutants were exclusively reactive with HNA-1b. Isoforms showing pan-reactivity had Ser65 and Asp82, and mutants carrying Asp65 and Asp82 where non-reactive. It appears that both outer amino acid (36 and 106) are not part of the epitope.
It was concluded that amino acids 65 and 82 are responsible for the formation of the HNA-1a and HNA-1b epitopes.
These results could not be confirmed by westernblot, most likely because the epitope structure is lost by denaturating the protein.
Beside the hitherto unknown epitope formation of HNA-1a and HNA-1b, the functional capacity of both isotopes with regard of IgG binding is also unclear in literature. Using recominant cell lines, HNA-1b was demonstrated to have slightly better IgG binding capacities than HNA-1a, but this difference did not reach the level of statistical significance. It remains currently unclear whether HNA-1a and HNA-1b neutrophils have different impact on neutrophil function in vivo.

OND
Antibodies to human neutrophil alloantigens (HNA) can cause immune-mediated neutropenias and transfusion complications. The diagnosis of antibodies to the HNA-5a (Ond) isoform of the aLb2 integrin is hampered by the lack of reliable methods for HNA-5a antigen typing. We have devised a polymerase chain reaction sequence-specific primer method (PCR-SSP) and used it to determine the HNA-5a gene frequencies in 320 individuals from different ethnicities.15,3% were found to be HNA-5a negative, with no significant deviation between the populations. Results of HNA-5a genotyping were in accordance with phenotyping. Availability of HNA-5a PCR-SSP will facilitate the diagnosis of Ond antibody-mediated clinical conditions.

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