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Charakterisierung der transendothelialen Migration von synovialen Fibroblasten bei der rheumatoiden Arthritis

Characterization of the transendothelial migration of synovial fibroblasts in the rheumatoid arthritis

Zimmermann, Birgit


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-82721
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8272/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): rheumatoide Arthritis , Fibroblasten , Endothelzellen , Migration , RNase
Freie Schlagwörter (Englisch): rheumatoid arthritis , fibroblasts , endothelial cells , migration , RNase
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Innere Medizin mit Schwerpunkt Rheumatologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.06.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 01.08.2011
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Dissertation wurden Mechanismen zur transendothelialen Migration der synovialen Fibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RASF) charakterisiert. Ein Schwerpunkt lag dabei auf der Interaktion der RASF mit Endothelzellen (EZ). Hierfür wurden verschiedene zellbiologische und molekularbiologische Methoden sowie funktionelle Testsysteme etabliert. Dies beinhaltete ebenfalls die Isolation und Charakterisierung von humanen EZ aus verschiedenen Gefäßarealen. Außerdem wurde das SCID-Maus Modell den Fragestellungen entsprechend angepasst und eingesetzt. Die Methoden wurden zur Analyse der Kinetik und der Mechanismen der transendothelialen RASF-Migration verwendet, um mögliche Ansatzstellen für neue Behandlungsmethoden der RA aufzeigen.
Der Ablauf der transendothelialen RASF-Migration konnte in verschiedene Phasen eingeteilt werden. Diese bestehen aus einer sehr frühen Induktion der Gefäßneubildung, einer transendothelialen Migration der RASF und einer Adhäsion an die Knorpelmatrix mit sofort beginnender Invasion. Die erste Phase und die damit einhergehende Gefäßpermeabilität sind essentiell für die sehr frühe Migration der RASF. Diese frühe Migration der RASF wurde durch den Nachweis von humanen Zellen in den murinen Milzen belegt. So stellte die Hemmung der RASF-vermittelten Gefäßinduktion eine sehr effektive Methode dar, die transendotheliale Migration der RASF zu reduzieren. Die durch RASF induzierte Gefäßneubildung konnte durch Bevacizumab effektiv gehemmt werden, da die Hemmung von VEGF alle drei möglichen Neovaskularisierungsarten im SCID-Maus Modell verringerte.
Weiterhin konnte auf den RASF eine mediumabhängige Expression des E-Selektin Liganden CD15s nach der Kultur mit RPMI immunhistochemisch nachgewiesen werden. In funktionellen Versuchen in vitro konnte gezeigt werden, dass die Kultur der RASF mit RPMI eine deutliche Adhäsionsverstärkung zur Folge hat. Außerdem stellte sich bei immunhistochemischen Analysen des Synovialgewebes von Patienten mit RA heraus, dass die Präsenz von CD15s mit einem erhöhten CRP-Gehalt der Patienten einhergeht. Der E-Selektin abhängige Mechanismus der endothelialen RASF-Migration konnte in vivo durch Verwendung von E- und P-Selektin-defizienten SCID-Mäusen belegt werden. Dabei wurde dieser Effekt aber längerfristig kompensiert. In vitro war ebenfalls eine verstärkte Adhäsion der RASF an E-Selektin zu beobachten. Im Gegensatz dazu, hatte P-Selektin in vitro als Adhäsionsmolekül keine Bedeutung bei der Bindung der RASF oder OASF.
Bei den Analysen zur Adhäsion von RASF an das Endothel stellte sich heraus, dass RASF ähnliche Mechanismen wie Leukozyten verwenden. So scheinen RASF mit Thrombozyten zu assoziieren. Im SCID-Maus Modell liegt das Adhäsionsmolekül CD42b am Endothel der Implantate vor und könnte somit bei der Adhäsion der RASF an das Endothel von Bedeutung sein.
Die Applikation von RNase reduzierte in vitro die IL-6-Sekretion durch RASF sowie als therapeutischer Ansatz in vivo die RASF-Invasion. Interessanterweise wiesen exDNase als auch exRNase einen reduzierenden Effekt auf die Invasion der RASF im ipsilateralen Implantat auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Methotrexat und Kortikostroide die Invasion der RASF in den koimplanierten, ipsilateralen Knorpel reduzieren, aber keinen Effekt auf die transendotheliale Migration der RASF haben. Bei den Biologika wies nur Bevacizumab einen reduzierenden Effekt auf die transendotheliale RASF-Migration auf, wohingegen weder Anakinra, Tocilizumab oder der Proteasom-Inhibitor Bortezomib einen Effekt aufzeigten.
Zusammenfassend lassen sich als zentrale Ergebnisse folgende Aussagen treffen:
1.) Die transendotheliale Migration der RASF läuft in mehreren Phasen ab, die schon früh nach der Implantation beginnen.
2.) Die Interaktion mit Endothelzellen über Adhäsionsmoleküle ist eine zentrale Voraussetzung für die transendotheliale Migration der RASF.
3.) Thrombozyten sowie extrazelluläre RNS und DNS beeinflussen die Migration und Invasion von RASF.
4.) Die Wirkung von immunsuppressiven Antirheumatika könnte zum Teil auf deren Effekt auf die Migration der RASF beruhen.
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Hemmung der sehr früh beginnenden transendothelialen RASF-Migration einen neuen therapeutischen Ansatz darstellt, der die Ausbreitung der Gelenkerosion bei RA-Patienten auf nichterodierte Gelenke verringern könnte.
Kurzfassung auf Englisch: This dissertation characterized the mechanisms of transendothelial migration of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis (RASF) and focused on the interaction of RASF with endothelial cells (EC). Different methods of cell biology and molecular biology as well as functional assays were established, such as the isolation and characterization of EC from different vascular areas. In addition, the SCID-mouse model of RA was adapted to the questions to be studied, specifically the analysis of the kinetics and the mechanisms of the transendothelial RASF migration and the discovery of new treatments approaches in RA.
The process of transendothelial RASF migration could be classified into different steps. The first step was the induction of vascularization which was induced very early. Then, transendothelial migration and adhesion followed. Finally, invasion into the cartilage matrix was visible. The first step of early neovascularization and the increased vascular permeability resulting from this were essential for the RASF migration. The early migration of RASF was confirmed by immunohistochemical detection of human cells in the murine spleen. Inhibition of RASF mediated vessel formation was an effective method to reduce the migration of RASF. Bevacizumab, a VEGF inhibitor, could be established as a migration inhibitor possibly because of its potential to reduce the three modes of neovascularization visible within the SCID-mouse model.
Furthermore, RPMI media-dependent expression of the E-selectin ligand CD15s could be demonstrated immunhistochemically. Stronger adhesion was visible in functional in vitro assays after substituting RPMI for DMEM in RASF cultures. In addition, the presence of CD15s in the synovial tissue of patients with RA was correlated with an increased CRP concentration in the blood serum. The role of E-selectin in endothelial RASF migration could be demonstrated in vivo using E- and P-selectin-deficient SCID-mice. However, in the long term this effect was compensated. In vitro, a stronger adhesion of RASF to E-selectin was visible but P-selectin did not affect binding of RASF or OASF.
In analyses of RASF adhesion it could be shown, that these cells use similar mechanisms as leukocytes for the adhesion to the endothelium. In that context it seems possible that RASF interact with platelets. In the SCID-mouse model, CD42b is present within the endothelium of the implants. Therefore, this mechanism might also be used by RASF.
Application of RNase in vitro decreased the IL-6 secretion by RASF and resulted in a reduced RASF invasion into the cartilage in an therapeutic approach in vivo. Interestingly, exDNse as well as exRNase showed an inhibitory effect on the invasion of RASF into the ipsilateral implant. Furthermore, it could be demonstrated that methotrexate and corticosteroids reduced the invasion of RASF into the coimplanted ipsilateral cartilage in vivo but they had no effect on the transendothelial RASF migration. From the biologics used only Bevacizumab showed an inhibitory effect on the transendothelial RASF migration whereas neither Anakinra nor Tocilizumab or the proteasome inhibitor Bortezomib showed any effect.
In summary the main results led to the following findings:
1.) The transendothelial RASF migration takes place in several steps which start very early after implantation.
2.) The interaction of endothelial cells via adhesion molecules is a central requirement for the endothelial transmigration of RASF.
3.) Platelets and extracellular RNA and DNA affect the migration and invasion of RASF.
4.) The outcome of immunosuppressive anti-rheumatic drugs may partially be due to their effect on RASF migration.
In conclusion, the inhibition of the very early transendothelial RASF migration could represent a new therapeutic approach, which could reduce the spreading of the articular erosion to non-affected joints in RA patients.
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