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Überprüfung der Tyrosinasehemmung von extrahierten Metaboliten des Tryptophanstoffwechsels von Malassezia furfur in vivo an humaner Epidermis mittels der Dopa-Reaktion von Bloch

Trinkaus, Marlene


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-81925
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8192/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Dermatologie und Andrologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 28.06.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Es konnte bei Versuchen zur Morphologie und Kultivierungsbedingungen von Malassezia-Hefen gezeigt werden, daß die Spezies Malassezia furfur auf einem Medium aus Agar, einer Lipidquelle und Tryptophan als alleiniger Stickstoffquelle ein braunes in den Agar diffundierendes Pigment bildet. Dieses könnte aufgrund der
Eigenfarbe sowie dem Vorweisen einer grünlichen Fluoreszenz verantwortlich für die charakteristische Pigmentierung mit auffallender Farbvarianz und anderen Eigenschaften der Erkrankungsherde bei Pityriasis versicolor sein. Durch Aufbereiten der Kulturen konnte ein bräunliches Rohextrakt isoliert werden, welches durch weitere chromatographische Auftrennung (Säulen- und Dünnschichtchromatographie) eine Vielfalt von Pigmenten mit unterschiedlichsten Eigenschaften zeigte. Hier konnten insbesondere Eigenschaften entdeckt werden, die mit der Pathogenese der Erkrankung in Einklang zu bringen sind, wie z.B. Fluoreszenz, Farbvarianz (Pigmentierung, Depigmentierung) sowie Schutz gegen UV-Strahlung.
Für diese Arbeit entscheidend war die Entdeckung von Pigmenten, die in in-vitro-Untersuchungen in der Lage waren, das Enzym Tyrosinase (photometrisch erfaßt) zu hemmen. Diese Hemmung der Melanogenese durch Bestandteile des Pigmentstoffwechsels könnte eine Erklärung für die Depigmentierungen bei Pityriasis versicolor alba bieten.
Anlehnend an diese Untersuchungen konnte diese Arbeit zeigen, daß sich diese Hemmung auf „semi-in-vivo-Bedingungen“ übertragen ließ, indem die isolierten Pigmente ebenfalls eine Hemmung der Melanogenese in der Dopa-Reaktion von Bloch aufwiesen.
Es konnte also hier eine Hemmung der Tyrosinase durch Metaboliten von M. furfur durch zwei differente Methoden nachgewiesen werden. Zum einen fand sich in vitro eine Hemmung der Enzymreaktion der Tyrosinase, welche photometrisch erfaßt wurde, zum anderen unter gleichen Bedingungen (Konzentration des Hemmstoffes etc.) in vivo eine Hemmung dargestellt durch die Dopa-Reaktion. Die Hemmung zeigte sich durch ein aus den Pilzkulturen hergestelltes Rohextrakt. Durch weitere säulen- und dünnschichtchromatographische Auftrennung konnte die Hemmung weiterhin einer einzelnen Säulenfraktion sowie letztendlich einer einzelnen Dünnschichtbande zugeordnet werden, so daß die Hemmung auf die Substanzen, aus denen sich die Bande zusammensetzt, eingegrenzt werden konnte. In Folgeversuchen konnten aus dieser Bande tryptophanabhängige Indolderivate mit tyrosinaseinhibitorischen Eigenschaften aufgereinigt werden.
Bei allen Verbindungen (Rohextrakt, Säulenfraktion, Dünnschichtbande) zeigte sich eine positive Korrelation zwischen Hemmstoffkonzentration und Stärke der Hemmung. Desweiteren zeigte sich nach Zugabe von externer Tyrosinase, daß diese Hemmung teilweise kompetitiv aufgehoben werden konnte.
In histologischen Zusatzuntersuchungen konnte gezeigt werden, daß mit Hilfe der Dopa-Reaktion auch Aussagen zur Anzahl angefärbter Melanozyten bzw. Menge des L-Dopa in den Melanozyten bei Probanden verschiedenen Alters bzw. Geschlechts sowie an verschiedenen Lokalisationen des Körpers gemacht werden konnten.
Kurzfassung auf Englisch: While studying the morphology and cultivation conditions of Malassezia yeasts, it was possible to demonstrate that the species / genus M. furfur in a minimal medium of agar, a lipid source and tryptophan as the only source of nitrogen, forms a brown pigment diffusing into the agar. Because of its natural colour and the provision of a green fluorescence, this pigment could account for the characteristic pigmentation with striking colour variance and other attributes observed in pathological lesions of pityriasis versicolor.

Reprocessing the cultures, it was possible to isolate a brown crude extract, which in further chromatographic separation (column and thin-layer chromatography) showed a variety of pigments featuring a wide range of different attributes. In this respect it proved in particular possible to detect properties which can be aligned with the complaints pathogenesis such as, for example fluorescence, colour variance (pigmentation, depigmentation) and protection from UV radiation. Decisive for this work was the discovery of pigments able to inhibit the enzyme tyrosinase in in vitro studies (ascertained photometric). This inhibition of melanogenesis by elements of the pigment metabolism could provide an explanation for the depigmentation observed with pityriasis versicolor alba.
Building on these studies the work in hand was able to show that this inhibition is transferable to „semi-in-vivo conditions“, by virtue of the fact that the isolated pigments also exhibited a melanogenesis inhibition in Blochs Dopa reaction.
It hence proved possible in this respect to document a tyrosinase inhibition by M. furfur metabolites by way of two different methods.
On the one hand the inhibition of the tyrosinase-catalysed reaction, which could be ascertained photometric, was found in vitro, and on the other an in vivo inhibition was represented by the Dopa reaction under the same conditions ( inhibitor concentration, etc.). The inhibition showed up through a crude extract produced from the fungal cultures. By way of further column and thin-layer chromatography separation, the inhibition could furthermore be assigned to a single column fraction and ultimately a single thin-layer band, enabling the inhibition to be narrowed down to the substances making up the band. It was in subsequent operations possible to filter tryptophan-dependent indol derivates with tyrosinase-inhibiting properties from this band.
All compounds (crude extract, column fraction, thin-layer band) showed a positive correlation between inhibitor concentration and inhibitory power. It could furthermore be shown that this inhibition can be partially lifted competitive, following the addition of external tyrosinase.
Additional histological studies showed that the Dopa reaction could also be used to arrive at statements concerning the number of discoloured melanocytes and/or quantity of L-Dopa in the melanocytes of probands of various ages and both sexes, as well as at various localizations on the body.
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