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Entwicklung einer ELISA-Hochdurchsatzmethode für RNA Interferenz-Experimente am Modellorganismus Caenorhabditis elegans

Development of an ELISA high-throughput screening method for RNAi-experiments using the model organism Caenorhabditis elegans

Heise, Vincent


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-81882
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8188/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): C. elegans , Phosphorylcholin , RNAi , ELISA , E. coli
Freie Schlagwörter (Englisch): C. elegans , phosphorylcholine , RNAi, ELISA , E. coli
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 22.06.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Phosphorylcholin-Modifikationen an Proteinen und Glycosphingolipiden spielen eine entscheidende Rolle für die Fähigkeit vieler Nematoden das menschliche Immunsystem zu modulieren und lange Zeit im Wirt zu persistieren. Dies führt zu einer Vielzahl chronischer Erkrankungen wie z.B. Onchozerkose oder Elephantiasis, aber auch zu einem verminderten Auftreten von Allergien oder autoimmunologischen Erkrankungen. Zur Erforschung der zugrundeliegenden Mechanismen ist C. elegans ein ausgezeichneter Modellorganismus.
In dieser Arbeit wurde eine Methode zum Screening von RNAi-Knockdowns in C. elegans etabliert. Es soll eine quantitative Bestimmung des PC-Gehaltes gegenüber dem Housekeeping-Antigen Ubiquitin für jeden RNAi-Stamm ermöglicht werden, um den möglichen Knockdown einer PC-Transferase oder anderer, bisher unbekannter, am PC-Stoffwechsel beteiligter, Enzyme zu erkennen. Die Identifizierung solcher Enzyme wäre ein wichtiger Ansatzpunkt für die Entwicklung von Medikamenten gegen Nematodeninfektionen.
Für das Hochdurchsatzscreening wurden die Abläufe von der Aufzucht der Würmer, über deren Synchronisation und Lyse, bis hin zu einem ELISA optimiert. Ubiquitin wurde als House-Keeping-Antigen, ein Phosphatpuffer als Bindungspuffer und The Blocking Solution als Blockierlösung ausgewählt und experimentell bestätigt. Durch die Verwendung eines Pipettierroboters wurden der Zeitaufwand minimiert und gleichzeitig große Kapazitäten für ein RNAi-Screening geschaffen.
Das prinzipielle Funktionieren der Methode wurde durch den Nachweis einer Ubiquitin-Hydrolase bestätigt.
Kurzfassung auf Englisch: Modifications with phosphorylcholine on proteins and glycosphingolipids play an important role for the ability of many nematodes to modulate the human immune system and to cause severe long-lasting infections like onchocerciasis or elephantiasis, but also decrease the risk of developing allergies or auto-immune diseases. C. elegans is an excellent model-organism for the investigation of the underlying mechanisms.
In this work a method for the high-troughput screening of RNAi-knockdowns in C. elegans has been established. A quantitative analysis of the PC-amount relative to the amount of ubiquitin for each RNAi strain was performed. This should allow the identification of enzymes involved in the PC synthesis pathways or even a PC-transferase, which would be a promising starting point for the development of drugs against nematode infections.
The workflow for the high-troughput screening from the cultivation of the worms, over their synchronisation and lysis, up to an ELISA has been optimized. Ubiquitin has been choosen as an house-keeping-antigen, a phosphate buffer for protein binding and The Blocking Solution for blocking. By the usage of a robot the necessary amount of time has been reduced and large capacities for RNAi-screening were established. By identifying an ubiquitin-hydrolase the functioning of the developed method has been proven.
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