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Untersuchungen zu Plastizität und Funktion des KSPV Core-Proteins

Riedel, Christiane Maria


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler 2011
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.737 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5712-1
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.01.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 07.03.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Das KSPV Core-Protein bildet zusammen mit dem viralen Genom das Nukleokapsid
des Viruspartikels. Seine Plastizität wurde durch gezielte Verkleinerung und
Vergrößerung der Core-kodierenden Region untersucht.
1) Deletionen der Core-Aminosäuren (AS) 179-180,194-198, 208-212 oder 254-255
wirken sich stark negativ auf die Bildung von Viruspartikeln aus. Große Bereiche
basischer AS (213-231) können ohne starke Reduktion der Virusproduktion entfernt
werden.
2) Eine Vergrößerung des Core-Proteins durch Duplikation oder Triplikation des
Core-Gens sowie durch das Einfügen von ein bis drei YFP-Genen zwischen zwei
Core-Genen ist möglich. Dabei werden die vergrößerten Proteine in die gebildeten
Viruspartikel integriert.
3) Die korrekte räumliche Anordnung von Core-Domänen ist für die Funktion des
Proteins essentiell.
4) Der Aminosäureaustausch Asparagin 2256 zu Tyrosin in der NS3-Helikase-
Domäne steigert die Virusbildung eines subvitalen KSPV, das für YFP-Core kodiert,
um mehr als das Hundertfache.
Von der Partikelbildung unabhängige Core-Funktionen sollten durch die
Charakterisierung eines Core-Deletions-KSPV (Vp1017) untersucht werden.
1) Das Vp1017 ist auf primären porzinen Zellen nicht vermehrungsfähig. Porzine
Zelllinien mit aktiviertem IFN-System zeigen eine stark verminderte Empfänglichkeit
für das Vp1017 und eine Reduktion der Virusproduktion.
2) Das Vp1017 besitzt ein nicht funktionelles Npro. Es erfolgt keine Abspaltung vom
viralen Polyprotein und somit auch keine Antagonisierung von IRF-3. Die Insertion
von fünf AS an der Npro-Core Spaltstelle ist ausreichend, um die Funktionalität von
Npro wiederherzustellen (VpCR85).
3) Die Empfänglichkeit von porzinen Zelllinien mit aktiviertem IFN-System für das
VpCR85 ist deutlich herabgesetzt. Diese Reduktion der Empfänglichkeit kann durch
das Vorhandensein von Core im Viruspartikel, in Abhängigkeit von der Menge,
teilweise bis gänzlich aufgehoben werden.
Kurzfassung auf Englisch: The CSFV nucleocapsid consists of the viral RNA genome and the Core-Protein. Its
plasticity was examined by diminuition and multitplication of the Core coding region
and by insertion of nonviral sequences between a Core dimer.
1) Deletion of Core amino acids (aa) 179-180, 194-198, 208-212 or 254-255 strongly
decreases virus formation. Large stretchtes of predominantly basic aa (213-233) can
be deleted without a significant reduction of virus production.
2) The enlargment of the CSFV Core-Protein by duplicating or triplicating the Core
coding region, as well as the insertion of one – three YFP genes between a Core
duplicate still allow for the generation of virus. These modified proteins are integrated
into the viral particles.
3) Correct spatial arrangement of Core domains is essential for function.
4) Virus output of a subvital CSFV encoding for YFP-Core increases more than 100-
fold if asparagin 2256 is exchanged to tyrosin.
A Core deletion CSFV (Vp1017) was employed to study assembly independent Core
functions.
1) Vp1017 is nonviable in primary porcine cells. The susceptibility of porcine cell lines
with an activated IFN-system for Vp1017 is strongly reduced. Additionally, virus
production is decreased.
2) The Npro of Vp1017 is non-functional due to lack of cleavage from the polyprotein
and inability to antagonize IRF3. An insertion of five amino acids at the Npro-Core
cleavage site (VpCR85) is sufficient to restore Npro function.
3) Porcine cell lines with an activated IFN-system exhibit a strong decline of
susceptibility for VpCR85. This loss of susceptibility is counteracted by presence of
Core in the virus particles, the effect being dependent upon the amount of Core that
is integrated into the particles.