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Uptake mechanism of Hepatitis B Virus into susceptible primary hepatocyte cultures

Aufnahmemechanismus des Hepatitis B Virus in suszeptible primäre Hepatozyten Kulturen

Kott, Nicole


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Hepatitis B Virus , primäre Tupaia Hepatozyten , Endozytose
Freie Schlagwörter (Englisch): Hepatitis B Virus , primary Tupaia hepatocyte , endocytosis
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Medizinische Virologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 19.01.2011
Kurzfassung auf Englisch: Hepatitis B virus (HBV) can infect only a few cell types including primary Tupaia
hepatocytes (PTH) which were used in this work. The aim of the study was to characterize
the early steps of HBV infection using pharmacological inhibitors and confocal microscopy.
The distinction between endocytosis in general and direct fusion with the plasma
membrane was made by using hypertonic sucrose concentrations. The fusion of Sendai
virus (SeV) with the plasma membrane and its infectivity was not affected, whereas the
infection of control viruses known to be taken up via endocytosis, e.g. Semliki Forest virus
(SFV) and Simian virus 40 (SV40), was impeded. The HBV infection was inhibited in a
dose-dependent manner, suggesting an endocytic uptake. The dynamin inhibitor Dynasore
completely inhibited the entry of SFV (clathrin-mediated endocytosis) and SV40 (caveolinmediated
endocytosis), but had no effect on HBV suggesting a dynamin-independent
internalization. Furthermore, the inhibitor of macropinocytosis EIPA did not impair HBV
infection. HBV was also not able to stimulate the macropinocytic activity of PTH. Also
phagocytosis could be ruled out as an entry mechanism. The actin inhibitors Jasplakinolide
(actin-stabilisation) or Cytochalasin D (actin-depolymerisation) resulted in a partial
inhibition of the early steps of HBV infection. The intracellular transport of HBV could be
constrained by utilization of Nocodazole, an inhibitor of microtubule-polymerisation. HBV
does not require an acidic pH within the endosomal compartments for the initiation of a
productive infection cycle and therefore differs from many other viruses that are
internalized via endocytosis (e.g. SFV, which was tested as control virus) and also from the
related hepatitis B virus of the duck. No parallels to the retrograde pathway of SV40 were
observed, since the HBV infection showed no sensitivity towards inhibitors of specific
intracellular transport mechanisms (Brefeldin A), ER protein folding and quality factors
(MG-132) and the translocation process to the cytosol (Thapsigargin). Together with
previous data it can be concluded that HBV is internalized via a not yet known, possibly
virus-induced, endocytic uptake mechanism, which is clathrin-, caveolin-, lipid raft- and
dynamin-independent and differs from the process of phagocytosis and macropinocytosis.
Kurzfassung auf Deutsch: Hepatitis B Virus (HBV) kann nur wenige Zelltypen infizieren, u.a. primäre Tupaia
Hepatozyten (PTH), die hier eingesetzt wurden. Die frühen Schritte der HBV-Infektion sind
noch unbekannt und sollten mithilfe von pharmakologischen Inhibitoren und konfokaler
Mikroskopie charakterisiert werden. Die Unterscheidung zwischen allen Arten von
Endozytosevorgängen und der direkten Fusion von Virushüllen mit der Plasmamembran
erfolgte durch Behandlung mit hyperosmolaren Sucrosekonzentrationen. Die Fusion des
Sendai Virus (SeV) mit der Plasmamembran und dessen Infektiosität wurden dadurch nicht
beeinflusst, während die Infektion endozytisch aufgenommener Kontrollviren, z.B. des
Semliki Forest Virus (SFV) sowie des Simian Virus 40 (SV40), unterbunden werden konnte.
Auch die Infektion mit HBV wurde dosis-abhängig inhibiert, was auf eine endozytische
Aufnahme schließen lässt. Der Dynamin-Inhibitor Dynasore konnte die Eintrittsprozesse
von SFV (Clathrin-vermittelte Endozytose) und SV40 (Caveolin-vermittelte Endozytose)
vollständig unterbinden, hatte jedoch keinen Einfluss auf die HBV-Infektion, was auf einen
Dynamin-unabhängigen Internalisierungsprozess hindeutet. Auch der Inhibitor der
Makropinozytose EIPA inhibierte die HBV-Aufnahme nicht. Außerdem stimulierte HBV
nicht die Makropinozytose in PTH. Phagozytose konnte als Eintrittsmechanismus ebenfalls
ausgeschlossen werden. Die Aktin-Inhibitoren Jasplakinolide (Aktin-Stabilisierung) bzw.
Cytochalasin D (Aktin-Depolymerisierung) führten zu einer partiellen Inhibition der frühen
Schritte der HBV Infektion. Der intrazelluläre Transport von HBV konnte durch Nocodazol,
einem Inhibitor der Mikrotubuli-Polymerisation, behindert werden. HBV benötigt für die
Infektion keinen sauren pH innerhalb der endosomalen Kompartimente und unterscheidet
sich damit von vielen anderen endozytisch aufgenommenen Viren (u.a. dem Kontrollvirus
SFV) und auch vom verwandten Hepatitis B Virus der Ente. Ein retrograder Aufnahmeweg
wie bei SV40 liegt bei HBV nicht vor, da entsprechende Inhibitoren bestimmter
intrazellulärer Transportprozesse (Brefeldin A), ER-Proteinfaltungs-und Qualitätsfaktoren
(MG-132) sowie des Translokationsprozesses ins Zytosol (Thapsigargin) wirkungslos
blieben. Zusammen mit früheren Daten kann postuliert werden, dass HBV über einen
bislang unbekannten, möglicherweise vom Virus selbst-induzierten, endozytischen
Aufnahmemechanismus internalisiert wird, welcher Clathrin-, Caveolin-, lipid raft- und
Dynamin-unabhängig ist und sich vom Prozess der Phagozytose und Makropinozytose
unterscheidet.