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Eine Untersuchung von zwei Tiermodellen auf ihre Eignung für Studien der Spermatogenese (Weißbüschelaffe, Callithrix jacchus) und der frühen Embryonalentwicklung (Rind, Bos taurus) des Menschen

Hecht, Nadine


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (17.299 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und –Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5688-9
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 04.01.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Der Histon-Protamin-Austausch ist nicht nur für die männliche Fertilität und die
Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen von entscheidender Bedeutung, sondern er scheint
auch einen Einfluss auf die Qualität und die Entwicklung von Embryonen zu haben. Der
Histon-Protamin-Austausch wird durch eine Histonacetylierung eingeleitet und erfolgt beim
Menschen nur zu etwa 85%. Man nimmt an, dass die acetylierten Resthistone in
Spermatozoen als epigenetische Signale eine wichtige Rolle für die frühe
Embryonalentwicklung spielen. Zahlreiche Untersuchungen zum Histon-Protamin-Austausch
während der Spermatogenese beim Mensch existieren bereits und liefern wertvolle
Informationen in Bezug auf die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen. Da menschliche
Embryonen aus ethischen Gründen nicht für wissenschaftliche Untersuchungen zur
Verfügung stehen, sind weiterführende Untersuchungen, die die frühe Embryonalentwicklung
betreffen, am Mensch nicht möglich. Aus diesem Grund lag der Fokus dieser Arbeit auf der
Etablierung eines Tiermodells für die Spermatogenese und die frühe Embryonalentwicklung
des Menschen. Im ersten Teil dieser Studie sollte geklärt werden, ob sich der Weißbüschelaffe
(Callithrix jacchus) als Tiermodell für die Spermatogenese des Menschen eignet. Hierzu
führten wir in-situ Hybridisierungen gegen Protamine und immunhistochemische
Untersuchungen gegen spezifisch an Lysin5 (H4K5ac) Lysin 8 (H4K8ac), Lysin 12 (H412ac)
und Lysin 16 (H4K16ac) acetyliertem Histon H4 an Biopsiematerial des Hodens von Mensch
und Callithrix jacchus durch und analysierten anschließend das Expressionsmuster. Da die
Protamin-1 Sequenz bei Callithrix jacchus noch nicht bekannt war, stellten wir zuerst eine
Sonde her. Protamine-1 (PRM-1) und Protamin-2 (PRM-2) waren in runden und
elongierenden Spermatiden detektierbar. Alle Antikörper gegen acetyliertes Histon H4
zeigten in runden und elongierenden Spermatiden positive Signale. H4K8ac und H4K16ac
zeigten zusätzlich in Spermatogonien des Menschen positive Signale, während beim
Marmoset H4K8ac und H4K12ac in diesen Zellen detektierbar waren. Der Antikörper gegen
H4K16ac zeigte beim Menschen bereits in den pachytänen Spermatozyten beginnend in
Stadium III der Spermatogenese eine positive immunhistochemische Reaktion. Zusätzlich zu
Hodenbiopsien führten wir immunhistochemische Untersuchungen an Ausstrichen von
ejakulierten Spermatozoen von Mensch und Callithrix jacchus durch. Alle Antikörper zeigten
eine positive Reaktion, jedoch variierte der prozentuale Anteil an positiven Spermatozoen
deutlich zwischen den vier eingesetzten Antikörpern. Western Blot Analysen von
homogenisiertem Ejakulat des Menschen und Callithrix jacchus mit den vier Antikörpern
konnten in beiden Spezies spezifische Banden feststellen. Die Präsenz von spezifisch an Lysin
5, 8, 12 und 16 acetyliertem Histon H4 in Spermatozoen beider Spezies zeigt, dass der
Histon-Protamin-Austausch nicht vollständig ist. Dies war beim Menschen bereits bekannt
und konnte in dieser Untersuchung auch für den Weißbüschelaffen gezeigt werden. Aufgrund
der Tatsache, dass der Mensch und der Weißbüschelaffe eine ähnliche Organisation des
Keimepithels aufweisen, der Histon-Protamin-Austausch bei Beiden nicht vollständig ist,
beide Spezies PRM-1 und PRM-2 exprimieren, und eine gleiche Expression von PRM-1 und
PRM-2 mRNA in runden und elongierenden Spermatiden zeigen, eignet sich der
Weißbüschelaffe als Tiermodell für den Histon-Protamin-Austausch im Menschen. Da
acetylierte Histone in Spermatozoen im Verdacht stehen mit Genen assoziiert zu sein, die den
Start der Transkription und die frühe Genexpression in der Zygote bedingen, also vom
Spermatozoon auf die Eizelle bei der Befruchtung übertragen werden, eignet sich der
Weißbüschelaffe unter Umständen auch als Tiermodell für die frühe Embryonalentwicklung
des Menschen.
In einem zweiten Teil dieser Studie wurde das Expressionsmuster von acht Genen in
Spermatozoen, Oozyten, Zygoten, 2-Zell und 4-Zell Embryonen von Callithrix jacchus und
Bos taurus mittels RT-PCR analysiert: Protamine-1 (PRM-1), Protamine-2 (PRM-2), Histon
H1 (H1), Histon H3 (H3), Histon H4 (H4), cAMP-responsive element modulator (CREM),
DNA Methyltransferase 1 (DNMT1) und TATA box-binding Protein (TBP). Unser Ziel war es
spermienspezifische Transkripte zu identifizieren, die vom Spermium auf die Oozyte während
der Fertilisierung übertragen werden. Es ist bekannt, dass diese Gene eine wichtige Rolle
während der Spermiogenese und frühen Embryonalentwicklung spielen. In Callithrix jacchus
und Bos taurus zeigten unsere Ergebnisse, dass PRM 1 Transkripte von Spermatozoen auf die
Oozyte übertragen werden. Mit unseren Ergebnissen bekräftigen wir die Hypothesen anderer
Studien, dass das Spermium mehr als nur Überbringer des männlichen Genoms ist, sondern
auch spermienspezifische Transkripte während der Fertilisierung auf die Oozyte überträgt, die
für die frühe Embryonalentwicklung essentiell sind.
Kurzfassung auf Englisch: Histone to protamine exchange is not only essential for male fertility and fertilizing capacity
of the spermatozoon, but is also thought to be of great importance for the quality and
development of the embryo. Histone acetylation is a prerequisite for correct histone to
protamine exchange, which in man is only 85% complete. Spermatozoa are transcriptionally
inactive cells, but contain histones normally a characteristic of transcriptionally active cells. It
is postulated that these remaining histones in spermatozoa, which are known to be highly
acetylated, represent epigenetic marks that are transmitted to the oocyte and may be involved
in starting gene expression in the zygote and in regulating gene expression during early
embryogenesis. Many studies on histone to protamine exchange during spermiogenesis in
man exist and deliver valuable information concerning fertilizing competency of spermatozoa.
While mRNAs in the oocyte are known to play an important role in both the zygote and early
embryo, to date, our information on the role of mRNAs in spermatozoa is only scarce. An
animal model is needed to be able to further investigate in this matter. For this reason, the first
main issue of this study was to establish an animal model for investigations on human
spermatogenesis and later on early embryo development which, in man, are not possible due
to ethical reasons.
In the first part of this study, we wanted to elucidate, if the marmoset (Callithrix jacchus) may
represent a suitable animal model for human spermatogenesis. For this purpose, we used insitu
hybridization and immunohistochemistry to analyze expression of protamine 1 (PRM-1)
and protamine 2 (PRM-2), and histone H4 specifically acetylated at lysine 5 (H4K5ac), 8
(H4K8ac), 12 (H4K12ac) and 16 (H4K16ac) in human and marmoset testes and ejaculates. As
the DNA sequence of protamine 1 from Callithrix jacchus was not known, we first amplified
marmoset protamine 1 from marmoset testes cDNA. PRM-1 and PRM-2 mRNA was present
in round and elongating spermatids. All antibodies against acetylated histones revealed
positive signals in these cells. Human spermatogonia showed positive signals for H4K8ac and
H4K16ac, whereas marmoset-spermatogonia were positive for H4K8ac and H4K12ac. In
man, H4K16ac displayed a positive immunoreaction already with pachytene spermatocytes
starting at stage III of the seminiferous epithelial cycle. All antibodies showed positive
immunostaining in ejaculated spermatozoa showing great variability between the four
antibodies and between the two species. Western blot analyses of protein extracts from
ejaculated spermatozoa of human and Callithrix jacchus using the four antibodies was also
performed and we observed specific bands for all four antibodies in both species. The
presence of histone H4 specifically acetylated at lysine 5, 8, 12 and 16 in spermatozoa of both
species shows that histone to protamine exchange is incomplete. This was already known for
man, but has now been demonstrated to be also true for the marmoset. This, and the fact that
human and marmoset exhibit a similar organization of the seminiferous epithelium, an
identical expression pattern of PRM-1 and PRM-2 mRNA in round and elongating spermatids
and similar expression of specifically acetylated histone H4, we come to the conclusion that
the common marmoset represents a suitable animal model for studies on histone and
protamine expression during human spermatogenesis. As acetylgroups are thought to
represent epigenetic marks that are transmitted to the oocyte by the spermatozoon during
fertilization and the fact that acetylated histones are present in spermatozoa of the common
marmoset, this might also make him a suitable animal model for comparative studies on the
role of spermatozoa derived mRNAs for embryonic development and early gene expression in
man.
In the second part of this investigation, we performed RT-PCR in Callithrix jacchus and Bos
taurus spermatozoa, oocytes, zygotes, 2-cell and 4-cell embryos to evaluate the presence of
specific transcripts known to play an important role during fertilization and early embryo
development, namely protamine 1 (PRM-1), protamine 2 (PRM-2), histone H1 (H1), histone
H3 (H3), histone H4 (H4), cAMP-responsive element modulator (CREM), DNA
methyltransferase 1 (DNMT1) and TATA box-binding protein (TBP). The goal of this part of
the study was to identify sperm-specific transcripts. Our data suggest that, in both Callithrix
jacchus and Bos taurus, PRM-1 transcripts are delivered from the spermatozoon to the oocyte.
With results from this study, we affirm the hypothesis of other studies, that sperm contribute
more than just their genome to the oocyte upon fertilization and that sperm-specific transcripts
exist and are essential for fertilization and early development and gene expression of the
embryo.